山楂承氣湯對(duì)高脂血癥性胰腺炎大鼠腸道屏障功能障礙的治療作用

陳亞峰 田繼云 謝金昆 王康 李紅昌 孔娉婷 樊信娟 涂佳敏 潘麗蕓 張曉芬 孫桂芳 奉典旭

近年來，高脂血癥性急性胰腺炎(hyperlipidemic acute pancreatitis，HAP)作為臨床常見的急腹癥發(fā)生率越來越高。HAP患者早期極易發(fā)生微循環(huán)障礙和腸道功能障礙，后期胰腺膿腫及假性囊腫等并發(fā)癥發(fā)生率也較高[1]。研究表明，毛細(xì)血管滲漏是HAP腸道功能障礙發(fā)病機(jī)制中十分重要的一環(huán)。連接黏附分子(junctional adhesion molecules, JAMs)位于內(nèi)皮細(xì)胞連接處，在細(xì)胞通透性中起重要作用。然而HAP時(shí)JAM-C表達(dá)的狀況及其與毛細(xì)血管通透性的關(guān)系尚不清楚。目前，臨床上通過胃管注入山楂承氣湯治療急性胰腺炎患者可顯著改善癥狀，緩解病情，減少并發(fā)癥發(fā)生。本研究應(yīng)用山楂承氣湯干預(yù)高脂血癥性急性壞死性胰腺炎(hyperlipidemic acute necrotizing pancreatitis，HANP)大鼠，觀察其對(duì)腸壁組織JAM-C表達(dá)及毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性SD大鼠120只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(80±10)g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2003-0002。按數(shù)字表法隨機(jī)分為高脂血癥(HL)組、HANP組、辛伐他汀治療組、山楂承氣湯治療組，每組30只。所有大鼠均先經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)4周，并稱重，禁食過夜后采用Takahashi等[2]和王亞軍等[3]方法經(jīng)股靜脈注入Triton WR1339 400 mg/kg體質(zhì)量以誘導(dǎo)高膽固醇、高三酰甘油血癥。6 h后HL組大鼠不做處置。其余3組采用Kimura等[4]的方法于腹腔內(nèi)注射雨蛙素50 μg/kg體質(zhì)量，間隔1 h，連續(xù)4次，并在第1次注射雨蛙素后6 h腹腔內(nèi)注射脂多糖(LPS)30 mg/kg體質(zhì)量制備HANP模型。辛伐他汀組于HANP制模前2 h，制模后2、4、12 h分別用辛伐他汀藥液灌胃1次，每次2.6 mg/kg體質(zhì)量。山楂承氣湯組同時(shí)間點(diǎn)灌胃1次，每次2 ml。方劑：大黃12 g、厚樸24 g、枳實(shí)12 g、芒硝6 g，山楂20 g，最后濃縮成100 ml。制模后(注射脂多糖后)6、12、24 h分批處死大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死8只。處死前1 h經(jīng)陰莖靜脈按1 ml/kg體質(zhì)量劑量注入2%伊文思藍(lán)染料(EB)。處死后抽取腹主動(dòng)脈血，離心分離血清，留取回腸部組織。剩余6只脫頸椎處死，不注射EB，但留取血及回腸組織。

二、血清淀粉酶、三酰甘油(TG )、游離脂肪酸(FFA)、JAM-C含量測(cè)定

血清淀粉酶活性由本院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(INTEGRA 400， COBAS)測(cè)定。TG 、FFA、JAM-C含量均采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)，按試劑盒說明書操作。

三、腸壁組織病理及超微結(jié)構(gòu)檢查

病理檢查按常規(guī)操作。超微結(jié)構(gòu)檢查采用透射電鏡觀察。

四、腸壁組織毛細(xì)血管通透性檢查

按照Seria等[5]報(bào)道的EB血管外滲法測(cè)定。取回腸組織300 mg，勻漿后加入1 ml甲酰胺，置60℃恒溫水浴24 h，離心取上清液，檢測(cè)杯調(diào)零，測(cè)620 nm處吸光度(A620)值。將EB粉劑倍比稀釋后，溶于1%白蛋白溶液，取300 μl，加入1 ml甲酰胺溶液，60℃恒溫水浴24 h，檢測(cè)杯調(diào)零，測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)濃度的A620值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

五、腸壁組織JAM-C mRNA表達(dá)檢測(cè)

取新鮮凍存的回腸組織，按試劑盒說明抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行熒光定量PCR(FQ-PCR)法測(cè)定JAM-C mRNA表達(dá)。JAMC-C正義引物：5′-GCACAAGGAAGACTCTGGGCAA-3′，反義引物5′-ATCACAGCAAGAACAATAAGGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物150 bp；內(nèi)參β-actin 正義引物5′-GAGCTATGAGCTGCCTGACG-3′，反義引物5′-AGCACTTGCGGTCCACGATG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物410 bp。引物由上海閃晶生物科技公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，△Ct值=CtJAM-C-CtGAPDH，采用公式2-△Ct×100%計(jì)算mRNA的表達(dá)量。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清淀粉酶、TG、FFA、JAM-C水平變化

HANP組、辛伐他汀組血清淀粉酶水平均顯著高于HL組(P值<0.05或<0.01)，但辛伐他汀組與HANP組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。山楂承氣湯組血清淀粉酶水平較HANP組及辛伐他汀組下降，其中12、24 h點(diǎn)與這兩組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值<0.05或<0.01)。此外，在24 h點(diǎn)亦較HL組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶含量的變化

HANP組血清TG水平與HL組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。辛伐他汀組和山楂承氣湯組血清TG水平均較HANP組顯著降低，且山楂承氣湯組的下降較辛伐他汀組更顯著(P值均<0.01，表2)。

表2 各組大鼠血清TG含量的變化

HANP組血清FFA水平與HL組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。辛伐他汀組和山楂承氣湯組血清FFA均較HANP組顯著下降，且12、24 h點(diǎn)山楂承氣湯組的下降較辛伐他汀組更顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，表3)。

表3 各組大鼠血清FFA含量的變化

HANP組血清JAM-C含量與HL組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。辛伐他汀組血清JAM-C含量?jī)H在6 h點(diǎn)較HANP組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。山楂承氣湯組JAM-C含量均較HANP組及辛伐他汀組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，表4)。

表4 各組大鼠血清JAM-C含量的變化

二、腸壁組織病理改變

HL組大鼠腸黏膜輕度水腫；HANP組大鼠腸黏膜水腫，部分腸黏膜微絨毛脫落，局灶出血和壞死明顯，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加重；山楂承氣湯組和辛伐他汀組的腸黏膜損傷均較HANP組減輕(圖1)。

三、腸壁組織超微結(jié)構(gòu)改變

HL組毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)完整，管內(nèi)少量紅細(xì)胞，形狀完整，組織間隙無明顯滲出。HANP組及辛伐他汀組腸壁組織毛細(xì)血管變薄，管壁有部分?jǐn)嗔眩軆?nèi)紅細(xì)胞聚集，細(xì)胞核向邊緣固縮，內(nèi)皮腔面不規(guī)整，褶皺及突起增加，基質(zhì)增厚，吞飲小泡融合，溶酶體腫脹，內(nèi)皮細(xì)胞核邊集，內(nèi)皮細(xì)胞連接除“窗孔”增加，周圍組織細(xì)胞變形，核膜增厚，組織間隙增寬。山楂承氣湯組毛細(xì)血管損傷較HAJP組減輕(圖2)。

圖1 HL組(1a)、HANP組(1b)、辛伐他汀組(1c)、山楂承氣湯組(1d)大鼠12 h點(diǎn)的腸黏膜病理變化(HE ×200)

圖2 HL組(2a)、HANP組(2b)、辛伐他汀組(2c)、山楂承氣湯組(2d)大鼠12 h點(diǎn)的腸壁組織毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)變化(×8200)

四、腸壁組織毛細(xì)血管通透性變化

HANP組、辛伐他汀組大鼠腸壁組織毛細(xì)血管通透性均顯著高于HL組(P值均<0.01)，但這兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。山楂承氣湯組腸壁組織毛細(xì)血管通透性僅在6 h點(diǎn)較HL組顯著升高(P<0.01)，其余時(shí)間點(diǎn)與HL組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較HANP組及辛伐他汀組均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，表5)。

五、腸壁組織JAM-C mRNA表達(dá)

HANP組、辛伐他汀組大鼠12、24 h點(diǎn)腸壁組織JAM-C mRNA表達(dá)量均顯著高于HL組(P值均<0.01)，但這兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。山楂承氣湯組腸壁組織JAM-C mRNA表達(dá)量與HL組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較HANP組及辛伐他汀組均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，表6)。

表5 各組大鼠腸壁組織EB含量變化

表6 各組大鼠腸壁組織JAM-C mRNA表達(dá)的變化

討 論

國內(nèi)外的研究表明，由高脂血癥引起的AP占AP病因的4%～8.5%[6-7]。高脂血癥引起的AP組織缺血嚴(yán)重，病情進(jìn)展迅速，可以很快發(fā)生廣泛的組織壞死，并發(fā)癥多，療效相對(duì)較差，病死率高。本研究制備的HANP大鼠與高脂飲食制備的HL組大鼠比較，血清TG、FFA、JAM-C含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但HANP組血清淀粉酶活性，腸黏膜損傷程度及通透性均較HL組大鼠顯著增加，提示HL不能直接導(dǎo)致胰腺炎的發(fā)生，但是是胰腺炎加重的重要因素，HANP組更符合臨床高脂血癥性重癥急性胰腺炎的狀況。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為HANP屬實(shí)熱蘊(yùn)結(jié)，腑氣不通證之癥。治療原則為通里攻下、清熱解毒、活血化瘀。本課題所用通里攻下經(jīng)典方劑大承氣湯，出自《傷寒論》，方中君藥大黃，味苦性寒，苦能降瀉，寒能清熱；厚樸《本草求真》言其：“氣辛則散，故于濕滿則宜；味苦則降，故于實(shí)滿則下。”枳實(shí)苦辛微寒，行氣消痞；芒硝則為中醫(yī)“熱淫于內(nèi)，治以咸寒”的代表藥。大承氣湯古代多主治外感熱病，現(xiàn)代多用于急腹癥的治療，其癥狀多見便秘、發(fā)熱及從胸至腹的脹滿疼痛[8]，現(xiàn)代藥理顯示大承氣湯能有效抑制細(xì)菌增殖生長(zhǎng)、降低血中內(nèi)毒素及各種炎癥介質(zhì)，清除體內(nèi)有毒性的自由基，增強(qiáng)組織細(xì)胞的抗氧化能力等[9]。常用中藥山楂，酸甘，微溫，入脾、胃、肝經(jīng)，具有消食化積、行氣散瘀的功效[10]。在AP治療中，山楂多與通里攻下、清熱解毒、活血化瘀等藥合用取得良好的療效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，山楂提取物能明顯降低高脂血癥患者和實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血TG和低密度脂蛋白濃度，升高高密度脂蛋白百分比值，這表明山楂能夠有效地降低血脂，并阻止自由基的生成[11]。辛伐他汀是臨床常用的降脂藥，尤其是降低膽固醇的水平。

本研究結(jié)果顯示，辛伐他汀組和山楂承氣湯組大鼠的血清淀粉酶、TG、FFA含量、腸黏膜損傷程度及通透性均較HANP組下降，且山楂承氣湯組的下降更顯著，提示辛伐他汀和山楂承氣湯均可以降低血脂水平及減輕胰腺、腸黏膜的損傷及腸壁通透性，其中又以山楂承氣湯組療效更顯著。

JAM-C是JAMs家族中重要的一員，在各種組織、器官中分布廣泛，在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血小板、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及淋巴管上均有表達(dá)。研究表明，JAM-C在內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附與連接中起重要作用，并與單核細(xì)胞的跨內(nèi)皮浸潤(rùn)、微血管通透性有關(guān)，在神經(jīng)細(xì)胞功能、眼科、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、炎癥性疾病等病變中起重要作用，因此可能成為臨床治療上述疾病的新靶點(diǎn)[12-14]。

在發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的JAM-C可以在血管內(nèi)皮細(xì)胞因子和組胺的作用下迅速且短暫地分布到細(xì)胞連接處，并且在中性粒細(xì)胞向炎癥部位和組織損傷處的浸潤(rùn)和聚集過程中起重要作用[15]。Vonlaufen等[16]報(bào)道，雨蛙素誘導(dǎo)的AP小鼠，其內(nèi)皮細(xì)胞上JAM-C的過度表達(dá)可以促進(jìn)胰腺炎病情的加重。本研究結(jié)果顯示，HANP組大鼠血清JAM-C含量與高脂血癥大鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但腸壁組織JAM-C mRNA表達(dá)量顯著增加，表明JAM-C mRNA的過表達(dá)參與對(duì)腸壁的損傷，增加腸黏膜的通透性。辛伐他汀組大鼠腸壁組織JAM-C mRNA的表達(dá)量與HANP組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而山楂承氣湯組大鼠腸壁組織JAM-C mRNA的表達(dá)量較HANP組顯著下降，提示山楂承氣湯通過下調(diào)JAM-C的表達(dá)，改善毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障，促進(jìn)組織水腫的吸收，減少組織間的出血及壞死，有效緩解高脂血癥性急性胰腺炎的病情。

參 考 文 獻(xiàn)

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