胰腺癌Capan-2細胞總RNA轉染樹突細胞誘導特異性抗腫瘤免疫反應的體外研究

陳江 牟為民 李宏宇 王迪 郭曉鐘

樹突細胞(dendritic cells, DCs)是體內功能最為強大的抗原遞呈細胞(antigen presenting cell, APS)，能夠刺激并致敏T淋巴細胞，產生細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lynphocytes, CTLs )，是機體免疫應答的核心。近年來出現的以DCs為基礎構建的腫瘤疫苗技術對多種腫瘤均有顯著的治療作用[1-3]。DCs腫瘤疫苗策略為胰腺癌的臨床治療開辟了新的思路[4]。構建腫瘤疫苗的關鍵在于負載抗原的選擇[5]。本研究將人胰腺癌Capan-2細胞總RNA電轉染胰腺癌患者DCs，以轉染黏蛋白4(MUC4)作為對照，觀察其誘導的CTLs對腫瘤靶細胞的殺傷作用，為臨床構建胰腺癌腫瘤全抗原DCs疫苗的開發和臨床應用提供依據。

材料與方法

一、一般材料及試劑

篩選2012年6月至2014年3月間沈陽軍區總醫院消化內科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者，男性4例，女性2例，年齡35～65歲，平均年齡50歲。全部患者均經組織病理學檢查(剖腹探查活檢4例，細針穿刺活檢2例)證實為胰腺癌。入選前未經放、化療及免疫治療。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

人胰腺癌細胞株MiaPaCa-2、Capan-2、AsPC-1和PANC1由沈陽軍區總醫院消化科實驗室保存；RPMI 1640、小牛血清購自Hyclone公司，重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、rhIL-4、TNF-α 購自PeproTec公司，鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83和CD86單抗購自Santa-Cruz公司，鼠抗人MUC4多抗購自Abcam公司，Trizol、 MTT、DMSO、Ficoll淋巴細胞分離液購自Sigma公司，NaCrO4購自中國同位素公司，γ-干擾素(IFN-γ)細胞因子檢測試劑盒購自BD公司，Sensiscript RT Kit、T7 mMessage mMachine kit購自Qiagen公司，BCA 蛋白檢測試劑盒購自Pierce公司，IFN-γ酶聯免疫吸附試劑盒購自Genzyme公司。

二、DCs的分離、培養和鑒定

參照文獻[6]方法，通過Ficoll密度梯度離心法分離來自胰腺癌患者100 ml的外周血單個核細胞(PBMCs)，貼壁培養1 h后取出未貼壁的細胞另作培養備用。貼壁細胞繼續培養20 h，更換新鮮培養液，加入rhGM-CSF(800 IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)。常規培養5 d后加入TNF-α(10 ng/ml)，培養至7 d收集成熟DCs。連續觀察體外培養5～10 d 的DCs形態學變化。用流式細胞儀分析DCs的特征性標志CD40和DC特征性成熟標志CD83、共刺激分子CD86以及MHC類分子HLA-DR等的表達水平。

三、蛋白質印跡法檢測癌細胞的MUC4表達

分別常規培養人胰腺癌細胞MiaPaCa-2、Capan-2、AsPC-1、PANC1，收集對數生長期細胞，懸于提取緩沖液冰上反應15 min。14 000 r/min離心20 min，測定上清的蛋白濃度后行蛋白質印跡法檢測MUC4，使用增強化學發光系統成像。選擇表達MUC4的Capan-2細胞進行后續實驗。

四、電轉染DCs

收獲Capan-2細胞，應用Trizol抽提細胞總RNA。采用Primer premier 5.0軟件設計MUC4及內參次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Hypoxanthine phosphor ribose transferase, HPRT)引物，并經GenBank驗證。MUC4上游引物5′-CGCGGTGGTGGAGGCGTTCTT-3′，下游引物5′-GAAGAATCCTGACAGCCTTCA-3′；HPRT上游引物5′-GGTTCTCGGGGCACCTCT-3′，下游引物5′-TCGGCTTGAAATGACCTAATG-3′。應用Sensiscript RT Kit將Capan-2總RNA逆轉錄獲得MUC4 cDNA，以1 μg cDNA為模板，應用T7 mMessage mMachine試劑盒將MUC4 cDNA 體外轉錄為MUC4 mRNA，按試劑盒說明書操作。同法提取PBMC總RNA。

參考文獻[7]的方法，取200 μl DCs細胞懸液3份，分別加入2 mm的電極杯，再分別加入20 μg的Capan-2總RNA、MUC4 mRNA、PMBC總RNA行電穿孔。電穿孔條件：電壓300 V、間隔125 ms、4個脈沖，持續250 ms。電穿孔后將電極杯置4℃冰箱靜置10 min，將DCs細胞懸液移入加有完全培養基的12孔培養板，37℃、5% CO2培養0～96 h，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測轉染后DCs的存活率。采用蛋白質印跡法檢測轉染72 h DCs的MUC4表達。3種轉染的DCs分別命名為DC-Capan-2-total RNA、DC-MUC4 mRNA、DC-PMBC-total RNA。

五、IFN-γ釋放實驗

分別以DC-Capan-2-total RNA、DC-MUC4 mRNA、DC-PBMC-total RNA作為刺激細胞，以患者自體PBMCs培養1 h后未貼壁T淋巴細胞作為反應細胞，按1∶1的比例混合，總體積為200 μl。常規培養24 h后采用IFN-γ酶聯免疫吸附試劑盒檢測培養上清中IFN-γ釋放量。結果以105反應細胞培養24 h的IFN-γ釋放量(U/ml)表示。實驗重復3次，取均值。

六、51Cr標準細胞毒實驗

以DC-Capan-2-total RNA誘導的特異性CTLs作為效應細胞，以4種體外培養的胰腺癌細胞Capan-2、MiaPaCa-2、PANC1和AsPC-1為靶細胞。將2×106個靶細胞與100μ Ci NaCrO4置1 ml的RPMI 1640中培養1 h，計數5×103個51Cr標記的靶細胞，與效應細胞按照不同的效∶靶比接種于200 μl RPMI 1640培養液，培養6 h后收集50 μl上清液，使用伽馬射線測量計數器測量每分鐘51Cr釋放量(CPM)。靶細胞溶解率=[(實驗CPM-自發CPM)/(最高CPM-自發CPM)]×100%。實驗重復3次，取均值。

七、統計學處理

結 果

一、DCs的分離、培養和鑒定

DCs經體外分離、培養，數量可達初始數量的10～15倍。鏡下見胞體向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規則突起，部分突起末端呈球狀膨大(圖1)。培養7 d的成熟DC表面標志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86的陽性表達率分別達34.3%、50.2%、89.2%和73.6%。

圖1 胰腺癌患者外周血PMBC培養第5天(1a)及第7天(1b)的DC形態(×200，×400)

二、體外培養癌細胞株的MUC4表達

Capan-2和AsPC-1細胞有MUC4表達，MiaPaCa-2和PANC1細胞無MUC4表達(圖2)。

1．PANC1細胞；2．AsPC-1細胞；3．Capan-2細胞；4．MiaPaCa-2細胞

三、轉染后DCs細胞的存活率及MUC4表達

6例患者的DC-MUC4 mRNA的存活率穩定在80%左右，而DC-Capan-2-total RNA的存活率呈時間依賴性降低，轉染后96 h 的存活率降低至60.8%，與DC-MUC4 mRNA的差異具有統計學意義(t=3.64，P<0.05，圖3)。DCs經Capan-2-total RNA或MUC4 mRNA轉染72 h后均檢測到MUC4表達，其中DC-MUC4 mRNA的表達量顯著高于同一患者DC-Capan-2-total RNA的表達量(表1，圖4)。

四、轉染的DCs誘導的CTLs的IFN-γ釋放量變化

DC-PBMC-total RNA及未轉染RNA的DCs對自體T淋巴細胞無明顯刺激及誘導作用，誘導的CTLs 24 h的IFN-γ釋放量分別為(2.29±0.13)、(5.37±0.44)U/ml，而DC-Capan-2-total RNA及DC-MUC4 mRNA誘導的CTLs的IFN-γ釋放量分別為(89.34±3.85)、(21.77±2.14)U/ml，兩者均顯著高于未轉染RNA的DCs誘導的CTLs的釋放量，且兩者間的差異有統計學意義(t=6.02，P<0.05)。

圖3 轉染后DCs的存活率

表1 6例轉染后的DCs的MUC4表達

圖4 6例轉染后的DCs的MUC4表達

五、DC-Capan-2-total RNA誘導的CTLs對胰腺癌細胞的殺傷作用

DC-Capan-2-total RNA誘導的特異性CTLs能夠有效識別和殺傷HLA-A2+/MUC4+的Capan-2細胞以及HLA-A2+/ MUC4-的PANC1細胞，而不能有效識別和殺傷HLA-A2-/MUC4-的MiaPaCa-2細胞和HLA-A2-/MUC4+的AsPC-1細胞(圖 5)。

圖5 DC-Capan-2-total RNA誘導的CTLs對不同HLA-A2表型的4種胰腺癌腫瘤細胞的殺傷作用

討 論

DCs在免疫反應進程中具有捕獲、處理、提呈腫瘤細胞抗原、引起初級和次級免疫反應的特殊功能[8]。使用不同的方法使之負載腫瘤抗原制備DCs腫瘤疫苗，誘導機體產生抗原特異性抗腫瘤免疫應答已成為近年來腫瘤免疫治療的研究熱點之一。胰腺癌DCs疫苗構建的一個關鍵問題在于選擇合適的腫瘤抗原。因胰腺癌缺乏特異性腫瘤抗原、異質性大、免疫原性差，使用單個腫瘤抗原負載DCs構建的胰腺癌腫瘤疫苗誘導的免疫反應較弱。使用腫瘤全抗原負載DCs構建胰腺癌疫苗則可激活針對不同腫瘤特異性抗原的多克隆細胞，減少腫瘤細胞克隆變異引起的抗原缺失，從而可以減少免疫逃逸的發生率，理論上是一種較具優勢的DCs腫瘤疫苗的構建方法[9]。

MUC4是高糖基化I型糖蛋白的一種，其過度表達與胰腺癌發生密切相關，被認為是胰腺癌免疫治療一個新標志物[10-11]。本研究證實胰腺癌Capan-2細胞表達MUC4蛋白，它可作為穩定內嵌在胰腺癌細胞全抗原譜中的標志抗原。通過檢測負載Capan-2細胞全腫瘤抗原的DCs中的MUC4相對表達量，即可間接判定DCs負載腫瘤全抗原的成敗及效率[12]。

RNA電轉染法具有操作簡單、安全、不受MHC遺傳背景影響等優點。本研究結果顯示，無論是Capan-2細胞抽提的總RNA還是體外擴增的MUC4 mRNA均可成功地轉染DCs，不同轉染組的DCs均有目標蛋白MUC4的表達，但轉染后72 h，負載Capan-2全抗原的DCs的MUC4表達量顯著低于負載MUC4單抗原的DCs，說明在DC的負載過程中可能存在某種RNA數量的依賴性。本研究結果還顯示，負載MUC4單抗原的DCs存活率穩定在80%左右，而負載Capan-2總RNA的DCs存活率在不同的時間點均顯著降低，這可能與負載較多類型腫瘤抗原引起DCs毒性增高和損傷增加有關。

轉染Capan-2總RNA和體外擴增的MUC4 mRNA的DCs均能在體外誘導CTL，其能力通常用IFN-γ的釋放量表示[13]。本研究結果顯示，負載胰腺癌細胞總RNA的DCs所誘導的CTLs活化能力強于負載MUC4單抗原的DCs所誘導的CTLs，與Van Tendeloo等[14]的研究結果類似。提示DCs誘導CTLs的能力可能與其所負載的抗原表位的數目有關，而與轉染RNA的多少無關。

主要組織相容性復合體(major histocompitibility complex,MHC)是由一群緊密連續的基因群組成，參與抗原的遞增，誘導細胞間相互識別及誘導免疫應答。人類MHC通常稱為HLA基因或HLA復合體。HLA-A2是MHC-Ⅰ類抗原。本研究引入的4種胰腺癌細胞株有不同的HLA-A2表型及MUC4的表達。2株HLA-A2+的Capan-2及PANC1細胞在體外均可被Capan-2全抗原特異性CTLs所識別和殺傷，而2株HLA-A2-的AsPC-1及MiaPaCa-2細胞卻沒有被Capan-2全抗原特異性CTLs所識別和殺傷，提示胰腺癌總RNA轉染的DCs所誘導的特異性CTLs能夠突破某一或某些抗原表位契合的限制，有效識別和殺傷其他腫瘤抗原決定簇相符的胰腺癌靶細胞，亦提示胰腺癌總RNA轉染的DCs所誘導的CTLs免疫反應不但是腫瘤相關抗原特異性的，同時也受到了MHC I類抗原遞呈的限制。

參 考 文 獻

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