Mesothelin抗體修飾的納米探針對人胰腺癌細胞BxPC3的體外靶向研究

盧明智 樂文俊 崔少斌 孫兵妹 陳炳地 邵成偉

間皮素(Mesothelin)在正常人體的胸膜、心包和腹膜上的間皮細胞表達。近年來的研究發現，絕大多數胰腺導管腺癌表達Mesothelin蛋白[1]，而正常胰腺組織及包括慢性胰腺炎在內的其他胰腺原發性疾病均無 Mesothelin表達[2-3]，提示Mesothelin有望成為攻克胰腺癌的分子標靶。本研究構建一種負載Mesothelin抗體的復合納米探針，并通過體外實驗評估該探針對人胰腺癌細胞BxPC3的靶向治療效果。

材料和方法

一、熒光納米Fe3O4@SiO2探針的合成

根據文獻[4-5]報道的方法合成熒光納米Fe3O4@SiO2探針。在氬氣保護下，往回流加熱反應裝置中加入乙酰丙酮鐵和三甘醇，緩慢加熱至沸騰，回流反應8 h。自然冷卻至室溫，磁分離洗滌數次后即得到穩定的Fe3O4溶液。在室溫機械攪拌下，向150 ml的錐形瓶中加入一定量的Fe3O4溶液、去離子水、無水乙醇和正硅酸乙酯(TEOS)，然后用氨水調節至pH值為9左右，繼續反應12 h，然后磁性分離，用去離子水洗滌6次以上即獲得Fe3O4@SiO2磁核。再經3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)修飾后獲得氨基化的Fe3O4@SiO2磁核。

根據文獻[6-7]報道的方法合成熒光量子點。在氮氣保護下，3 ml去離子水中加入0.10 g硼氫化鈉(NaBH4)和0.127 g碲(Te)粉，80℃下攪拌反應30 min，制備碲氫化鈉(NaHTe)溶液備用。氮氣保護下，在100 ml去離子水中加入0.457 g氯化鎘(CdCl2)和420 μl巰基丙酸，用1 mol/L NaOH調節pH值為11～12，劇烈攪拌30 min，然后迅速加入上述新制備的NaHTe溶液，混合溶液立即變為橘紅色，然后置100℃下攪拌反應7 h，異丙醇沉淀，離心后，用2 ml二次水重懸沉淀即獲得在紫外激發下發紅色熒光的CdTe量子點。

根據文獻[8-9]報道的方法合成熒光納米Fe3O4@SiO2探針。取0.5 ml上述量子點原液，加入50 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、50 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、2 ml活化緩沖液[pH5.0的0.01 mol/L乙烷磺酸溶液(含0.05% Tween-20)]，垂直旋轉反應30 min，然后加入4 mg氨基化的磁核，垂直旋轉儀上反應12 h。反應結束后磁分離并去離子水洗滌3次后獲得熒光納米Fe3O4@SiO2探針。

二、Mesothelin抗體修飾的熒光納米Fe3O4@SiO2探針的合成

取2 mg羧基化的量子點-磁珠，加入500 μl活化緩沖液，在漩渦振蕩器上混合均勻，加入2.5 mg EDC和2.5 mg NHS，室溫下活化反應30 min。然后用pH 9.0、0.005 mol/L的硼酸鹽吐溫緩沖液(含0.05%Tween-20)作耦聯緩沖液，再加入0.5 ml 100 μg/ml的Mesothelin抗體，室溫反應2 h，磁分離后用5% BSA進行封閉，最后將探針重懸于2 ml PBS，4℃存儲備用。

三、體外靶向實驗

人胰腺癌細胞BxPC3由長海醫院消化科饋贈，常規培養傳代。取對數生長期細胞分別與5 μl 1 mg/ml經5% BSA封閉處理后未修飾Mesothelin抗體的熒光納米探針和Mesothelin抗體修飾的熒光納米探針共孵育30 min；人肝癌細胞株HepG-2由同濟大學生物醫學工程與納米科學研究院饋贈，常規培養傳代。取對數生長期細胞與5 μl 1 mg/ml的Mesothelin抗體修飾的熒光納米探針共孵育30 min。孵育結束后均經PBS洗滌3次，通過電荷耦合器件(CCD)熒光成像系統觀察探針與細胞的吸附情況。

四、磁分離實驗

取對數生長期BxPC3細胞，重懸于高糖DMEM培養液中，分別與50 μl 1 mg/ml經5%BSA封閉處理后未修飾Mesothelin抗體的熒光納米探針、Mesothelin抗體修飾的熒光納米探針共孵育30 min，磁分離后分別計數上清和PBS重懸后沉淀中的細胞數。以HepG-2和K562細胞作為對照。吸附效率=100%×N沉淀中細胞數/N上清和沉淀中的總細胞數。

結 果

一、熒光納米探針的形態特征

熒光納米探針外觀呈球形，形狀較規則，中心黑色的部分為電子密度較大的磁核，周圍灰色的部分為無定形SiO2包裹層(圖1a)。納米探針的顆粒大小較均勻，多數流體動力粒徑在120～140 nm間(圖1b)。

圖1 熒光納米探針的投射電鏡(a)及粒徑分布(b)

二、熒光納米探針與細胞的吸附狀況

未交聯抗體的探針與BxPC3、HepG-2、K562細胞的吸附效率分別為(18.8±2.7)%、(15.8±2.4)%、(16.6±2.1)%，均低于20%。交聯Mesothelin抗體的探針與BxPC3、HepG-2、K562細胞的吸附效率分別為(53.9±1.8) %、(8.0±2.1)%、(8.9±2.3)%，其與BxPC3細胞的吸附能力顯著提高(圖2)。

圖2 未交聯抗體的熒光探針(上)、交聯Mesothelin抗體的探針(中)與BxPC3細胞，交聯Mesothelin抗體的探針與HepG-2細胞(下)共孵育后CCD熒光成像系統鏡下所見(左)及其UV激發下攝片(右)

討 論

胰腺癌是一種惡性程度較高的腫瘤，其致死率在癌癥中高居第4位。由于胰腺癌發病早期缺乏典型征象，且癌細胞生長快速，大多數患者確診時已屬晚期，胰腺癌對放化療不敏感，手術切除率僅為10%～15%。因此，胰腺癌的早期診斷對于治療和預后具有重大意義。

納米探針技術在生物和醫學領域的研究已成為一個很有生命力的新方向。由于納米探針易可控修飾，生物相容性好，又可賦予良好的光學性質和局域場增強效應等優勢，使其在生物組織成像、癌癥的診斷和治療方面的應用研究更加廣泛。本研究構建了磁性-熒光的雙功能納米探針，在其表面修飾Mesothelin抗體，結果顯示經Mesothelin抗體修飾的納米探針可定向地識別高表達Mesothelin的人胰腺癌細胞BxPC3，具有明顯的靶向識別細胞受體的能力。由于正常組織的間皮細胞亦表達Mesothelin，因此，還需要通過體內實驗進一步探討該技術的安全性及應用價值。

參 考 文 獻

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