MSI2在胰腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

高志剛 郭克建 宋少偉

胰腺癌惡性程度高，預(yù)后差，病死率居所有惡性腫瘤的第4位[1]。近年來(lái)，盡管診斷技術(shù)和治療手段不斷提高，但其早期診斷仍然困難，手術(shù)切除率低，5年生存率始終低于5%[1]。Musashi2(MSI2)屬于進(jìn)化保守的RNA結(jié)合蛋白Musashi家族成員之一，它位于17號(hào)染色體，是干細(xì)胞或祖細(xì)胞的標(biāo)志物之一。文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]，MSI2參與急性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生、發(fā)展，是該病的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。He等[4]報(bào)道，MSI2與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有關(guān)，并且可作為肝癌預(yù)后潛在的生物學(xué)標(biāo)記物，有助于肝癌術(shù)后的診斷和治療。Emadi-Baygi等[5]報(bào)道，MSI2與胃癌的分級(jí)有關(guān)。但其在胰腺癌中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)中MSI2的表達(dá)，并探討其臨床意義。

材料和方法

一、材料

收集 2005年1月至2013年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胰腺外科收治的61例具有完整臨床資料并經(jīng)病理證實(shí)的PDAC手術(shù)切除標(biāo)本，以配對(duì)的癌旁組織為對(duì)照。其中51例有完整的隨訪資料。另取10例新鮮的PDAC及配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本，置液氮中冷凍保存。兔抗人MSI2單抗購(gòu)自美國(guó)ABCAM公司。SP法免疫組化試劑盒、DAB顯色液購(gòu)自福州邁新公司。蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、上樣緩沖液、BCA定量及ECL發(fā)光試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物公司。RNA分離試劑 Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR037S)、SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 試劑盒等均購(gòu)自日本Takara公司。本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

二、MSI2蛋白檢測(cè)

取10%甲醛固定的組織標(biāo)本,石蠟包埋、切片、常規(guī)行免疫組化SP法檢測(cè)MSI2蛋白的表達(dá)。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。每張切片在高倍顯微鏡下隨機(jī)選取 5個(gè)視野，參考文獻(xiàn)[6]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的1%～24% 計(jì)1分，25%～49%計(jì)2分，50%～74%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分；無(wú)著色0分，淺黃色1分，黃色或深黃色2分，褐色或棕褐色3分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘，≥4分為高表達(dá)。

另取液氮保存的新鮮組織，應(yīng)用蛋白裂解液制備勻漿，經(jīng)BCA定量蛋白濃度后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MSI2蛋白的表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參。最后ECL發(fā)光并以凝膠顯像儀 (MF-chemibis 3.2 DNR，以色列)顯像，采用quantity one軟件計(jì)算條帶面積和密度的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

三、MSI2 mRNA檢測(cè)

采用Trizol提取并純化新鮮組織總RNA，采用Takara逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，按說(shuō)明書(shū)操作。MSI2上游引物5′-GCCCTTTGTTTAGGTGATGTC-3′，下游引物5′-CAGCAGATTCGTGAGATGATG-3′；GAPDH上游引物5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，下游引物5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。 引物均由Takara公司設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系：TaKaRa 2×SYBRR Premix Ex TaqTM12.5 μl，100 nmol/L上下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，H2O 8.5 μl；反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)復(fù)孔，并以DEPC水代替模板cDNA作為陰性對(duì)照。通過(guò)儀器自帶軟件獲取Ct值，采用公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCt =(ΔCt癌組織目的基因-ΔCt癌組織內(nèi)參基因)-(ΔCt癌旁組織目的基因-ΔCt癌旁組織內(nèi)參基因)。以癌旁組織的表達(dá)量為1，計(jì)算癌組織的表達(dá)倍數(shù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。配對(duì)的癌與癌旁組織蛋白和mRNA表達(dá)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。MSI2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier單因素分析計(jì)算累積生存率，生存期差異行Log-Rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PDAC組織和癌旁組織MSI2蛋白表達(dá)

PDAC組織MSI2主要表達(dá)在癌細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核內(nèi)(圖1a)，61例PDAC中39例(63.9%)MSI2高表達(dá)；癌旁正常胰腺組織MSI2主要表達(dá)于胰島細(xì)胞，胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞呈弱表達(dá)，腺泡細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)(圖1b)，25例(41.0%)MSI2高表達(dá)。癌組織MSI2的高表達(dá)率明顯高于相應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.809，P=0.007)。

圖1 PDAC組織(1a)及癌旁正常胰腺組織(1b)MSI2的表達(dá)(免疫組化 ×200)

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示癌組織MSI2蛋白的表達(dá)量為0.748±0.195，癌旁組織為0.420±0.171，癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.689，P=0.005，圖2)

圖2 癌組織(T)及配對(duì)癌旁組織(N)MSI2蛋白的表達(dá)

二、PADC組織及配對(duì)癌旁組織MSI2 mRNA的表達(dá)

10例PADC組織MSI2 mRNA的表達(dá)量為癌旁正常胰腺組織的(2.507±2.981)倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.660，P=0.026，圖3)。

圖3 10例PDAC組織及配對(duì)癌旁組織MSI2 mRNA的表達(dá)量

三、MSI2蛋白表達(dá)與PDAC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

癌組織MSI2蛋白表達(dá)僅與腫瘤大小呈正相關(guān)(χ2=5.096，P=0.024)，而與其他參數(shù)均無(wú)明顯相關(guān)性(表1)。

表1 癌組織MSI2表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例數(shù))

四、MSI2蛋白表達(dá)與胰腺癌患者術(shù)后生存期的關(guān)系

51例獲取隨訪的PDAC患者中，MSI2高表達(dá)30例，術(shù)后中位生存期為321 d，低表達(dá)21例，術(shù)后中位生存期為730 d，高表達(dá)者的生存期顯著短于低表達(dá)著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.706，P=0.010，圖4)。

討 論

胰腺癌發(fā)病率逐年上升，早期診斷困難，手術(shù)切除率低，對(duì)化療及放療欠敏感，尋找與胰腺癌相關(guān)的分子標(biāo)志物具有重要的臨床意義。Kharas等[3]通過(guò)小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSI2高表達(dá)可增加造血干細(xì)胞的增殖，并且與癌基因BCR-ABL1共同參與了慢性粒細(xì)胞白血病的侵襲進(jìn)展,證實(shí)了MSI2可作為急性白血病新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。Mu等[7]檢測(cè)116例B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者的MSI2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明B-ALL參與該病的發(fā)生發(fā)展，是其獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。He等[4]檢測(cè)149例肝癌癌及癌旁組織和40例正常肝組織的MSI2基因表達(dá)，結(jié)果顯示癌組織明顯高表達(dá)，而癌旁及正常肝組織罕有表達(dá)。文獻(xiàn)[3,8-14]還報(bào)道，急性髓系白血病、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌及腦膜癌組織的MSI2基因均明顯高表達(dá)。然而，Emadi-Baygi等[5]報(bào)道，胃癌與癌旁組織的MSI2基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示，與癌旁正常胰腺組織比較，MSI2在PDAC中表達(dá)亦明顯上調(diào)。

圖4 PADC患者的生存曲線

何璐等[11]報(bào)道，MSI2高表達(dá)的肝癌患者的腫瘤侵襲性強(qiáng)，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高,可能發(fā)揮潛在的癌基因功能，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。此外，MSI2與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，可作為肝癌預(yù)后潛在的生物學(xué)標(biāo)記物，有助于肝癌術(shù)后的診斷和治療[4]。王婭菲等[13]發(fā)現(xiàn)，MSI2 在低分化結(jié)腸腺癌中高表達(dá)。低分化癌一般具有較高的惡性程度和較差的預(yù)后，提示其可能是結(jié)腸腺癌患者預(yù)后不佳的預(yù)測(cè)指標(biāo)。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，MSI2高表達(dá)的急性白血病患者預(yù)后不良[3，7,9]。本研究結(jié)果亦顯示，胰腺癌組織MSI2表達(dá)與腫瘤大小呈正相關(guān)，高表達(dá)MSI2的PDAC患者預(yù)后差。這些結(jié)果均提示MSI2可以作為評(píng)估多種腫瘤患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2009[J].CA Cancer J Clin, 2009,59(4):225-249.

[2] Thol F, Winschel C, Sonntag AK, et al. Prognostic significance of expression levels of stem cell regulators MSI2 and NUMB in acute myeloid leukemia[J].Ann Hematol, 2013,92(3):315-323.

[3] Kharas MG,Lengner CJ,Al-Shahrour F,et al.Musashi-2 regulates normal hematopoiesis and promotes aggressive myeloid leukemia[J]. Nat Med, 2010,16(8): 903-908.

[4] He L, Zhou X, Qu C, et al. Musashi2 predicts poor prognosis and invasion in hepatocellular carcinoma by driving epithelial-mesenchymal transition[J]. J Cell Mol Med, 2014,18(1):49-58.

[5] Emadi-Baygi M, Nikpour P, Mohammad-Hashem F,et al. MSI2 expression is decreased in grade Ⅱ of gastric carcinoma[J]. Pathol Res Pract, 2013,209(11): 689-691.

[6] Supuran CT. Carbonic anhydrase inhibitors and activators for novel therapeutic applications[J]. Future Med Chem, 2011,3(9):1165-1180.

[7] Mu Q, Wang Y, Chen B, et al. High expression of Musashi-2 indicates poor prognosis in adult B-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Res, 2013,37(8):922-927.

[8] Ito T, Kwon HY, Zimdahl B, et al. Regulation of myeloid leukaemia by the cell-fate determinant Musashi[J]. Nature, 2010,466(7307):765-768.

[9] Griner LN,Reuther GW.Aggressive myeloid leukemia formation is directed by the Musashi2/Numb pathway[J]. Cancer Biol Ther, 2010,10(10):979-982.

[10] 鄒秀平，黃偉，劉珊珊，等.MSI2和NUMB在白血病中的表達(dá)和分析[J].臨床血液學(xué)雜志,2013,26(5):319-321.

[11] 何璐，周新科，洪健.肝細(xì)胞癌中Musashi2的表達(dá)及意義[J].廣東醫(yī)學(xué), 2013,34(20):3152-3154.

[12] 莫碧文,李勞冬,于會(huì)娜,等.Musashi2在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013, 48(12):1480-1483.

[13] 王婭菲,林中,盧青,等.Musashi2、CD133在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)[J].天津醫(yī)藥, 2013,41(12):1153-1155.

[14] Cox JL, Wilder PJ, Gilmore JM,et al,The SOX2-interactome in brain cancer cells identifies the requirement of MSI2 and USP9 X for the growth of brain tum or cells[J]. PLoS One, 2013,8(5):e62857.