維生素K對去卵巢大鼠肝氧化應激及炎癥因子的影響

潘春芳，徐三榮

（1.江蘇大學臨床醫學院，江蘇鎮江212013；2.金壇市中醫醫院婦產科，江蘇金壇213200；3.江蘇大學附屬醫院普外科，江蘇鎮江212001）

維生素K對去卵巢大鼠肝氧化應激及炎癥因子的影響

潘春芳1，2，徐三榮3

（1.江蘇大學臨床醫學院，江蘇鎮江212013；2.金壇市中醫醫院婦產科，江蘇金壇213200；3.江蘇大學附屬醫院普外科，江蘇鎮江212001）

目的：探討補充維生素K對去卵巢大鼠肝氧化應激及炎癥的影響。方法：以去卵巢SD大鼠作為圍絕經期模型，比較維生素K補充與不補充對肝組織丙二醛，超氧化物歧化酶（SOD），還原型谷胱甘肽（GSH）等氧化應激指標以及腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）的影響。將30只6月齡雌性SD大鼠隨機分為3組，每組均為10只，即假手術組，去卵巢組以及去卵巢后補充維生素K組（維生素K組）。術后1周開始分組給藥，維生素K組將維生素K混于丙三醇中每日灌胃，而假手術組和去卵巢組每日給予丙三醇灌胃。90 d后，取肝組織測定丙二醛，SOD，GSH；冰凍切片行蘇木素-伊紅（HE）與活性氧（ROS）熒光染色；免疫印跡檢測TNF-α和IL-6的表達。結果：維生素K組肝組織丙二醛水平較去卵巢組明顯降低，但明顯高于假手術組（P均＜0.05）。維生素K組肝組織SOD，GSH水平均較去卵巢組明顯降低（P＜0.05），與假手術組比較差異無統計學意義。形態學檢測表明維生素K組肝細胞胞質內小空泡數目明顯少于去卵巢組，而假手術組則未見空泡；維生素K組肝細胞內活性氧熒光強度明顯低于去卵巢組，與假手術組相近。免疫印跡結果表明維生素K組肝內TNF-α與IL-6表達水平均介于去卵巢組和假手術組之間；去卵巢組兩種因子水平明顯高于假手術組。結論：去卵巢大鼠肝組織處于較高的氧化應激狀態，并伴有促炎因子表達增高，這種改變能在一定程度上被維生素K緩解。

維生素K；去卵巢；肝；氧化應激；白介素6；腫瘤壞死因子α

絕經后卵巢功能下降常伴有肝內氧化應激水平增高和促炎因子的增加［1］。氧化應激水平增高主要由脂質過氧化物產生增加和（或）抗氧化物減少所致，嚴重時會引起肝細胞損傷。肝內促炎因子的增高如腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）也可能會損傷肝細胞［2］。這些改變與絕經后雌激素水平降低密切相關。故絕經后補充雌激素能緩解絕經帶來的肝氧化損傷，但雌激素替代療法易增加乳腺癌和其他婦科腫瘤的發病率［3］。維生素K的結構與雌激素有相近之處。雖然其經典效應主要為參與凝血，但最近的研究表明維生素K不僅能改善絕經后骨質疏松的癥狀，而且具有較強的抗氧化能力，能夠降低氧化應激對細胞的損傷［4－5］。我們以6月齡大鼠去卵巢模型模擬絕經，觀察肝內氧化應激水平與炎癥因子的表達，同時觀察維生素K補充對這些改變的干預效果。由于維生素K1有著較強的抗氧化能力，故本實驗主要研究維生素K1的干預效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6月齡健康雌性SPF級SD大鼠30只，體質量（350±20）g，由江蘇大學實驗動物中心提供。實驗動物給予分籠飼養，在（24±2）℃，12 h晝夜條件下，給予顆粒飼料喂養。

1.2 試劑及儀器

維生素K1和2-硫代巴比妥酸（TBA）購自Sigma公司（批號：V3501，T5500），超氧化物歧化酶（SOD，WST法）與還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。活性氧染色試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司。RIPA裂解液購自加拿大Fermentas公司。IL-6，TNF-α抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，β-肌動蛋白抗體及HRP耦聯二抗購自美國Santa Cruz公司，PVDF膜及化學發光劑購自德國Millipore公司。BCA蛋白測定試劑盒購自美國Thermo公司。μQuant酶標儀購自美國BioTek公司，冰凍切片機及熒光顯微影像系統購自德國萊卡公司，電泳儀購自美國Bio-Rad公司，凝膠成像系統購自北京賽智創業科技有限公司。

1.3 動物分組及造模

實驗按照隨機區組設計。大鼠編號后以隨機數字表法分成3組，分別為假手術組，卵巢切除組（去卵巢組）及卵巢切除補充維生素K1組（維生素K組），每組各10只。去卵巢組和維生素K組大鼠按如下操作進行手術。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位固定，腹部備皮消毒；腹正中線作切口，切開肌肉，找到兩側輸卵管，依次切除末端卵巢；結扎出血處，縫合各層組織結構，縫合腹腔。假手術組大鼠操作與此一致，只是僅僅切除卵巢周圍的一小塊脂肪組織后止血，縫合腹腔。術后3 d注射青霉素以預防感染。維生素K組術后1周開始補充維生素K1。具體方法是將維生素K1溶于甘油中，每日以20 mg／kg的劑量灌胃，每周末稱重調整下周維生素K1補給量。去卵巢組與假手術組則給予相近劑量的甘油灌胃。飼養90 d后，處死大鼠，以PBS從門靜脈灌洗肝臟后分離凍存于超低溫冰箱內待用。

1.4 肝臟丙二醛，SOD及GSH的測定

以超聲法制備10%肝組織勻漿，以500×g轉速離心除沉淀，取上清進行測定。丙二醛測定采用TBA法：將三氯乙酸沉淀蛋白后加入1%TBA，95℃水浴80 min，冷卻后應用酶標儀測定532 nm處的光密度值。SOD與GSH的測定按照試劑盒說明書進行。采用BCA法測定蛋白濃度。丙二醛，SOD與GSH測定結果均以蛋白濃度進行校正。

1.5 肝臟蘇木素-伊紅染色及活性氧熒光染色

取各組大鼠肝組織進行冰凍切片（8μm）以備染色。分別以蘇木素和伊紅（HE）滴染切片，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明后以中性樹膠封片。同時對冰凍切片進行活性氧熒光染色，原理為2′，7′-二乙酰二氯熒光素（DCFH-DA）在胞內能被分解為無熒光的DCFH，而DCFH能被活性氧氧化成發綠色熒光的DCF。具體操作步驟按試劑盒進行。染色后的切片置于萊卡顯微鏡分別以普通光和熒光進行攝影和記錄。

1.6 蛋白質印跡法檢測肝組織IL-6和TNF-α的表達

RIPA裂解液制備10%的肝組織勻漿，加入上樣緩沖液，100℃加熱5 min使蛋白變性。制備10%的分離膠和5%的積層膠，電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉1 h，以一抗孵育過夜，洗膜，HRP耦聯的二抗孵育1 h，洗膜，涂加發光劑，于凝膠成像系統上進行曝光，記錄結果。每組取6只大鼠的肝臟進行免疫印跡檢測，曝光結果使用成像系統自帶軟件進行灰度分析以便統計。所用的一抗包括兔抗大鼠IL-6，TNF-α（稀釋比例均為1∶300），小鼠抗大鼠β-肌動蛋白（1∶3000）。二抗為HRP耦聯的羊抗兔及羊抗小鼠抗體（1∶10 000）。

1.7 統計學處理

應用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，測定結果以均數±標準誤表示。先進行方差齊性檢驗和單因素方差分析，然后以LSD-t法兩兩比較組間差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補充維生素K對去卵巢大鼠肝臟丙二醛，SOD以及GSH的影響

與假手術組比較，去卵巢組大鼠肝內丙二醛明顯升高（t＝4.768，P＜0.01），而SOD和GSH明顯降低（t＝2.739，P＜0.05；t＝2.523，P＜0.05）。假手術組與維生素K組相比，上述3項氧化應激指標差異無統計學意義（丙二醛、SOD以及GSH的t值分別為1.341，0.484，0.155，P均大于0.05）。與去卵巢組比較，維生素K組大鼠肝組織丙二醛明顯降低（t＝3.427，P＜0.01），而SOD與GSH均明顯升高（t＝2.255，P＜0.05；t＝2.678，P＜0.05）。見圖1。

圖1 3組大鼠肝組織丙二醛，SOD及GSH水平比較

3.2 補充維生素K對卵巢切除大鼠肝組織形態及活性氧含量的影響

HE染色表明，與假手術組比較，去卵巢組肝細胞的胞質內存在較多5μm左右的空泡，而維生素K組空泡數明顯減少。各組肝細胞的形態和排列未見明顯差別。活性氧染色可見去卵巢組中熒光彌散地分布在肝細胞胞質內，細胞核呈黑色空洞狀，位于細胞中央。假手術組和維生素K組的熒光都極弱。因此，去卵巢組肝細胞內熒光強度明顯高于其他兩組，而維生素K組和假手術組之間差異不明顯。見圖2。

圖2 各組肝組織病理形態的變化（HE染色與活性氧熒光染色）

3.3 維生素K對去卵巢大鼠肝組織IL-6和TNF-α表達的影響

蛋白質印跡結果顯示，肝內IL-6的表達水平從高到低依次為去卵巢組，維生素K組，假手術組。TNF-α表達水平的高低次序與此一致，只是各組間差異小于IL-6間的差異。統計學分析表明，去卵巢組肝內TNF-α和IL-6的表達明顯高于維生素K組和假手術組（與維生素K組比較，IL-6：t＝3.946，P＜0.01，TNF-α：t＝2.219，P＜0.05；與假手術組比較，IL-6：t＝4.500，P＜0.01，TNF-α：t＝3.159，P＜ 0.01）。而IL-6和TNF-α在維生素K組與假手術組之間的差異均無統計學意義（IL-6：t＝0.554，TNF-α：t＝0.940，P均大于0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠肝組織中IL-6和TNF-α的表達水平

4 討論

研究證實卵巢切除會打破大鼠肝臟中抗氧化-氧化系統的平衡［6］，主要表現為肝勻漿中丙二醛升高，GSH降低。丙二醛是脂質過氧化的終產物，可反映組織內脂質過氧化程度，因而成為衡量細胞自由基損傷程度的常用指標［7］。GSH是非酶類抗氧化劑的代表性物質，其他的還包括抗壞血酸，生育酚等。本研究結果也證實了卵巢切除后3個月，大鼠肝臟內丙二醛升高，GSH降低。而關于肝內酶類抗氧化系統特別是SOD在卵巢切除后的變化則存在不同的研究結果。Konyalioglu等［8］研究表明，卵巢切除5周后大鼠肝內SOD水平上升。而另一些研究結果顯示，卵巢切除則會降低大鼠肝內SOD水平［9－10］。我們的研究結果與后者一致，這可能是由于本實驗在卵巢切除后第97天才分離檢測肝臟SOD水平。因為卵巢切除后肝內氧化因子和抗氧化因子會出現波動性變化，很可能早期出現一定程度的代償，而晚期才出現降低［6］。

維生素K與雌激素都屬脂類激素，主要參與凝血過程。近年來，維生素K在改善絕經后骨質疏松等方面的潛力已成為一個研究熱點，這提示維生素K與雌激素的生理功能間可能存在交集。另一方面，維生素K能夠通過抑制12脂氧化酶的激活對抗少突膠質細胞中由花生四烯酸引起的氧化損傷［11］。動物實驗還證實，補充維生素K能夠降低老齡雌性大鼠的認知缺陷［12］。本實驗結果表明，維生素K同樣能夠降低卵巢切除大鼠肝內氧化應激水平，具體表現在大鼠肝內丙二醛降低，而SOD和GSH均升高。維生素K的這種肝內抗氧化效應可能也與12脂氧化酶有關，詳細的機制尚需進一步的研究。

活性氧是指細胞在代謝過程中由氧化還原反應產生的、并在分子組成上含氧的一類化學性質極其活潑的物質總稱，氧自由基是其中最重要的一類。氧自由基包括超氧陰離子、羥自由基、單線態氧等能使無熒光的染料氧化成有熒光的物質［13］。本實驗表明，卵巢切除后肝內活性氧水平異常升高，彌散分布在胞質內，而維生素K則能使之降低到正常水平。活性氧易與膜內各種脂質發生過氧化反應形成以丙二醛為代表的脂質過氧化物，進一步驗證了卵巢切除后肝內氧化應激水平的升高及維生素K的保護作用。

肝內氧化應激與活性氧的升高常伴有TNF-α等炎癥因子的增多，從而進一步加重肝細胞損傷［14］。24月齡大鼠卵巢切除后，肝內TNF-α，IL-6，iNOS，HO-1等多種炎癥因子顯著升高［15］。本實驗結果表明6月齡雌性大鼠卵巢切除后，肝內炎癥因子同樣也顯著升高，而這種升高能被補充維生素K部分性地抑制。故維生素K具有抑制炎癥反應的效應，這與之前的報道一致。維生素K能夠抑制脂多糖誘導的肝內炎癥反應，此效應與TNF-α和IL-6這兩種因子的抑制密切相關［16］。維生素K還能通過抑制核因子κB來抑制脂多糖誘導的炎癥反應［17］。

卵巢切除大鼠肝內氧化應激、活性氧以及促炎因子水平的升高很可能與雌激素突降導致的非酒精性脂肪肝（NAFLD）有關［18］。雌激素水平突降使體內性激素之間的平衡發生很大變化，導致總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇明顯升高，高密度脂蛋白膽固醇急劇降低，造成血液及其他組織器官中脂質及其代謝產物的異常而出現脂代謝紊亂，脂肪在體內堆積而形成肥胖，增加了高血壓、心血管疾病、2型糖尿病和NAFLD等慢性疾病的風險［19］。肝HE染色顯示去卵巢組肝細胞內存在較多的小空泡，類似于空泡狀變性，提示肝細胞能量代謝的紊亂。而補充維生素K后大鼠肝細胞內的空泡明顯減少，但并未完全消失，說明維生素K的保護作用并不完全。此結果提示脂質代謝紊亂可能是卵巢切除大鼠肝氧化應激與促炎因子升高的根本原因。而維生素K或許能夠通過部分性地糾正脂質代謝紊亂，改善肝臟的狀態［20］。

綜上，維生素K對抑制絕經后肝氧化應激具有一定的實用價值，但仍需大量基礎及臨床研究來進一步確定其機制和適宜劑量，畢竟過多脂溶性維生素攝入仍存在蓄積中毒的可能性。維生素K與雌激素聯用是否能夠獲得更高的安全性和更好的效果也需要進一步研究。

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Effects of phylloquinone on hepatic oxidative stress and inflammatory factors in ovariectom ized rats

PAN Chun-fang1，2，XU San-rong3

（1.School of ClinicalMedicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Departmentof Gynaecology and Obstetrics，Jintan Traditional Chinese Medical Hospital，Jintan Jiangsu 213200；3.Departmentof General Surgery，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To observe the effects of phylloquinone supplementation on hepatic oxidative stress and inflammation in ovariectomized rats and to propose a new way to prevent the hepatic impairment associated with menopause.M ethods：Thirty female SD rats of sixmonths agewere randomly divided into 3 groups，sham group（Sham，n＝10），ovariectomy group（OVX，n＝10），phylloquinone supplementation after ovariectomy group（OVX＋VK，n＝10）.One week after operation，phylloquinone or glycerol which served as delivery agent was administrated through gastric lavage to OVK＋VK group or Sham and OVX group respectively for 90 days.After that，the livers were harvested to determine malonaldehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD）and glutathione（GSH）levels.Hematoxylin eosin（HE）and reactive oxygen species（ROS）fluorescent staining were performed on hepatic frozen sections.The expressions of IL-6 and TNF-αin the livers were evaluated by Western blotting.Results：The hepatic MDA levels in the OVX＋VK group were significantly lower than those in the OVX group and higher than those in the Sham group（both P＜0.05）.The hepatic SOD and GSH levels in the OVX＋VK group were significantly lower than those in the OVX group，but were not significantly different from those in the Sham group.HE stainingdemonstrated that the small vacuoles in the OVX＋VK group were obviously fewer than those in the OVX group while the livers in Sham group contained no vacuole.The ROS fluorescence in the hepatic sections in the OVX＋VK group wasweaker than that in the OVX group.The results ofWestern blotting demonstrated that the levels of IL-6 and TNF-αin the OVX＋VK group located between the other two groupswhile those in the OVX group were higher than those in the Sham group.Conclusion：The liver of ovariectomized rats was under higher oxidative stress concomitant with higher levels of inflammatory factors as compared with that of normal rats.These changes can be alleviated by phylloquinone supplementation to some extents.

phylloquinone；ovariectomy；liver；oxidative stress；IL-6；TNF-α

R339.22；R458.7

A

1671－7783（2014）01－0031－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y130236

潘春芳（1979—），女，江蘇金壇人，主治醫師，碩士研究生；徐三榮（通訊作者），主任醫師，碩士生導師，E-mail：1695071511＠qq.com

2013－10－07 ［編輯］陳海林