伏馬霉素通過上調TGF-β信號通路促進HepG2細胞增殖

曾甜甜，盧小東，陳路芳，陳園園，邵啟祥

（江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212003）

伏馬霉素通過上調TGF-β信號通路促進HepG2細胞增殖

曾甜甜，盧小東，陳路芳，陳園園，邵啟祥

（江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212003）

目的：研究伏馬霉素B1（Fumonisin B1，FB1）對人肝癌HepG2細胞株增殖的作用及相關機制。方法：人肝癌HepG2細胞株接種至培養皿，分別設0、0.5、1.0、10、50μmol／L伏馬霉素濃度的DMEM培養液，處理48 h后，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況并計數。在此基礎上，通過CCK-8實驗觀察FB1對細胞增殖的影響，實時熒光定量PCR檢測轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、Smad4（Drosophila mothers against decapentaplegic 4，Smad4）、纖溶酶原激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）mRNA的表達。結果：FB1作用后，倒置顯微鏡下觀察HepG2細胞有絲分裂象明顯增加；CCK-8實驗結果顯示，不同濃度FB1處理48 h后，HepG2細胞增殖隨FB1濃度的增加而增加，呈劑量依賴性。實時定量PCR結果顯示，與對照組相比，10μmol／L組和50μmol／L組Smad4，PAI-1mRNA表達均顯著上調，而0.5μmol／L組和1.0μmol／L組與對照組相比，差異無統計學意義；各濃度組TGF-β1mRNA均較對照組顯著上調。結論：FB1可以有效促進HepG2細胞增殖，其機制可能與上調TGF-β1，Smad4，PAI-1mRNA表達，即TGF-β信號通路有關。

伏馬霉素；細胞增殖；轉化生長因子-β1；信號通路；HepG2細胞

伏馬霉素B1（Fumonisin B1，FB1）是一種由串珠鐮刀菌（Fusarium verticillioides）污染玉米和玉米食品產生的真菌毒素［1］。伏馬霉素不僅可以引起豬肺水腫綜合征、馬腦白質軟化癥和鼠肝腎損傷，還可對其他畜禽及實驗動物造成多種毒性作用進而誘發腫瘤，而且與人類食管癌、肝癌的發生也有著非常密切的關系［2－3］。伏馬霉素主要通過抑制神經鞘氨醇的生物合成，阻礙鞘脂類代謝，進而誘發肝癌、食管癌［4］。

現已知伏馬霉素可誘導多種細胞凋亡，對人、動物具有潛在的致癌作用，但具體致癌機制目前還不明確［5］。近來研究發現，伏馬霉素在一定條件下可促進細胞增殖，可能為其又一致癌機制［6］。本實驗將伏馬霉素作用于人肝癌HepG2細胞，觀察其促進細胞增殖的情況，同時測定TGF-β信號通路相關蛋白轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、Smad4（Drosophila mothers against decapentaplegic protein4，Smad4）、纖溶酶原激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）mRNA表達水平，以進一步探討伏馬霉素誘導癌癥發生的機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

人肝癌HepG2細胞株由本室提供；伏馬霉素購自Enzo Life Sciences公司；小牛血清購自杭州四季青公司；細胞計數試劑盒（Cell Counting Kit8，CCK8）購自碧云天生物研究公司；Trizol購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購買自大連TaKaRa公司；RT-PCR涉及的引物均由上海Invitrogen有限公司設計；MQX200酶標儀購自Gene公司；AXIO Observer A1型光學顯微鏡為Carl Zeiss公司產品；熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人肝癌細胞株HepG2的培養 用含10%小牛血清，100 U／L青霉素，100 mg／L鏈霉素的DMEM于37℃，5%CO2孵育箱中培養人肝癌HepG2細胞株。細胞呈貼壁成長，選擇對數生長期的細胞，隨機分為對照組和處理組。

1.2.2 伏馬霉素處理HepG2細胞 將對數生長期人肝癌HepG2細胞株分別接種于6孔（105／孔）、96孔（104／孔）培養板，37℃，5%CO2恒溫箱中培養24 h，分別設0、0.5、1.0、10、50μmol／L伏馬霉素濃度的DMEM，培養液處理48 h后，繼續進行下一步實驗。

1.2.3 伏馬霉素處理后細胞增殖狀態觀察 伏馬霉素處理48 h后，取接種于96孔培養板的HepG2細胞于光學顯微鏡下觀察生長狀態，并拍照。

1.2.4 CCK-8法測定細胞增殖 取對數生長期的HepG2細胞株，分別接種于96孔板中，104／孔，培養24 h；取伏馬霉素濃度為0、0.5、1.0、10、50μmol／L的系列培養基各100μL，分別加入對應的孔，其中0 μmol／L為陰性對照組，同時設立空白孔（含培養基不含藥物與細胞）進行校正，每組樣本3個復孔。培養48 h后，于對應的孔加入CCK-8試劑10μL，繼續培養2 h。酶標儀450 nm波長下檢測各孔的光密度（D）值。

1.2.5 實時熒光定量PCR測定TGF-β信號通路相關基因 人肝癌HepG2細胞株經0、0.5、1.0、10、50 μmol／L濃度伏馬霉素處理48 h后，棄培養基，加入Trizol試劑，提取總RNA。用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度，反轉錄合成cDNA。反應體系：總RNA 500 ng，5×反轉錄聚合酶鏈反應緩沖液2μL，去RNA酶蒸餾水補足至10μL；反應條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃保存。以合成的cDNA進行熒光定量PCR。反應體系：樣品cDNA 1.5μL、上下游引物各0.5μL、實時熒光定量反應混合液5μL、雙蒸水2.5μL，總體積為10μL；反應條件：95℃30 s，95℃5 s，GAPDH 60℃（TGF-β1 56℃，Smad4 59℃，PAI-1 58℃）10 s，72℃30 s，40個循環后制作熔解曲線。實驗結果以公式2－ΔΔCt進行處理，以GAPDH為內參照，以未加藥組基因的mRNA相對表達量為1.0，定量分析各處理組基因mRNA的相對表達水平。各基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統計學處理

數據處理采用SPSS 13.0軟件進行多組間均數比較與單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 伏馬霉素對人肝癌細胞HepG2分裂和增殖的影響

不同濃度伏馬霉素處理HepG2細胞48 h后，呈分裂象的細胞數明顯增加，與陰性對照組相比，0.5 μmol／L組、1.0μmol／L組有絲分裂像細胞差異無統計學意義，而10μmol／L、50μmol／L處理組分裂像細胞明顯增加，并呈劑量依賴性。與陰性對照組相比，0.5μmol／L組、1.0μmol／L組細胞增殖速度無明顯變化（P均＞0.05），而10μmol／L、50μmol／L組細胞增殖速度明顯增加（P均＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖1～2。

圖1 不同濃度伏馬霉素對HepG2細胞分裂數的影響

圖2 不同濃度伏馬霉素對HepG2細胞增殖的影響

2.2 伏馬霉素對TGF-β信號通路的影響

用不同濃度伏馬霉素處理人肝癌HepG2細胞48 h后，與陰性對照組相比，各濃度處理組TGF-βmRNA表達均顯著上調，且呈劑量依賴性（F＝42.91，P＜0.05）。同樣，與陰性對照組相比，各濃度處理組Smad4、PAI-1 mRNA表達水平皆顯著上調（Smad4：F＝28.95，P＜0.000 1；PAI-1：F＝33.86，P＜0.000 1），其中0.5μmol／L組、1.0 μmol／L組Smad4 mRNA水平和0.5μmol／L組PAI-1 mRNA水平與陰性對照組相比，差異均無統計學意義，其余組別與陰性對照組比較，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見圖3。

3 討論

自1988年首次分離出伏馬霉素后，其毒性在人畜體內、體外實驗中陸續得到證實［7］。玉米中伏馬霉素的污染現象在全球非常普遍，且常與其他致癌性霉菌毒素（如黃曲霉毒素、雜色曲霉素及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等）混合污染［8］。流行病學調查發現，國內外某些地區食管癌發病率與當地糧食中伏馬霉素的污染情況成正相關，且動物實驗結果表明，伏馬霉素可誘發某些嚙齒類動物肝臟及腎臟腫瘤的發生［9］。現已知伏馬霉素可誘導多種細胞凋亡，對人、動物存在潛在的致癌作用，但其引起細胞凋亡和致癌的機制目前仍然不清楚［10］。

圖3 伏馬霉素處理后TGF-β1，Smad4和PAI-1 m RNA的表達水平

細胞有增殖、分化和凋亡三方面的特性，其中，增殖是細胞生命活動的重要特征之一，在保持細胞數目的恒定、衰老與更新等方面起著重要的作用。機體創傷愈合、組織再生、病理組織修復等，都要依賴細胞增殖［11］。細胞的異常增殖可導致疾病的產生，如再生障礙性貧血、前列腺肥大、動脈粥樣硬化、高IgM血癥和惡性腫瘤等［12－14］。細胞增殖加快導致分化不全，即低分化、去分化或逆分化，進而導致腫瘤發生［15］。本研究結果顯示，FB1處理HepG2細胞48 h后，細胞增殖明顯增加，其機制可能與FB1抑制了神經酰胺合酶從而促進HepG2細胞增殖有關。

TGF-β具有調節信號轉導、促進細胞外基質的形成、調節細胞周期、促進血管生成和骨髓造血、趨化和免疫等功能［16］。近來研究表明，TGF-β在腫瘤發生早期有抑制作用［17］，但隨著腫瘤的發生發展，即抑癌基因失活、原癌基因突變以及染色體易位，TGF-β的抑制作用轉變為加強腫瘤的運動、侵襲和轉移［18］。另有研究指出，TGF-β信號通路可通過影響脂類代謝從而促進疾病的發生發展［19］。本實驗結果表明，隨著伏馬霉素濃度的增加，HepG2細胞的增殖呈明顯上升趨勢，且TGF-β，Smad4，PAI-1 mRNA的表達顯著上調。伏馬霉素是神經酰胺合酶的抑制劑［20］，其抑制機制可能與鞘氨基醇競爭結合神經酰胺合酶有關［21］，研究證實神經酰胺合酶在體外對肝癌起抑制作用［22］。本結果顯示，伏馬霉素對人肝癌HepG2株細胞增殖有明顯的促進作用，并且呈劑量依賴性，其機制可能與神經酰胺合酶的合成受到阻礙有關［23］，具體有待進一步研究。另外，本實驗采用熒光定量PCR檢測TGF-β信號通路相關蛋白mRNA的變化，結果顯示TGF-β Smad4 PAI-1軸mRNA表達均不同程度上調，且呈劑量依賴性。這提示了伏馬霉素促進細胞增殖的機制可能與TGF-βSmad4 PAI-1信號通路的上調有關，但其促進細胞增殖的具體機制目前仍不清楚，有待進一步研究。

［1］ Gelderblom WC，Jaskiewicz K，MarasasWF，et al.Fumonisins—novel mycotoxins with cancer-promoting activity produced by Fusarium moniliforme［J］.Appl Environ Microbiol，1988，54（7）：1806－1811.

［2］ Alizadeh AM，Rohandel G，Roudbarmohammadi S，et al.Fumonisin B1 contamination of cereals and risk of esophageal cancer in a high risk area in northeastern Iran［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（6）：2625－2628.

［3］ Persson EC，Sewram V，Evans AA，et al.Fumonisin B1 and risk of hepatocellular carcinoma in two Chinese cohorts［J］.Food Chem Toxicol，2012，50（3／4）：679－683.

［4］ Mullen TD，Jenkins RW，Clarke CJ，et al.Ceramide synthase-dependent ceramide generation and programmed cell death：involvement of salvage pathway in regulating postmitochondrial events［J］.J Biol Chem，2011，286（18）：15929－15942.

［5］ Igarashi D，Bethke G，Xu Y，et al.Pattern-triggered immunity suppresses programmed cell death triggered by fumonisin b1［J］.PLoSOne，2013，8（4）：e60769.

［6］ Halasiddappa LM，Koefeler H，Futerman AH，et al.Oxidized phospholipids induce ceramide accumulation in RAW 264.7 macrophages：role of ceramide synthases［J］.PLoSOne，2013，8（7）：e70002.

［7］ MarasasWF，Jaskiewicz K，Venter FS，et al.Fusarium moniliforme contamination ofmaize in oesophageal cancer areas in Transkei［J］.SAfr Med J，1988，74（3）：110－114.

［8］ Yoshinari T，Tanaka T，Ishikuro E，et al.Inter-laboratory study of an LC-MS／MSmethod for simultaneous determination of fumonisin B1，B2 and B3 in corn［J］.Shokuhin Eiseigaku Zasshi，2013，54（4）：266－276.

［9］ Gelineau-van Waes J，Starr L，Maddox J，et al.Maternal fumonisin exposure and risk for neural tube defects：mechanisms in an in vivo mouse model［J］.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2005，73（7）：487－497.

［10］ Gelderblom WC，Abel S，Smuts CM，et al.Fumonisininduced hepatocarcinogenesis：mechanisms related to cancer initiation and promotion［J］.Environ Health Perspect，2001，109（Suppl2）：291－300.

［11］ Merrill AH Jr.，van Echten G，Wang E，et al.Fumonisin B1 inhibits sphingosine（sphinganine）N-acyltransferase and de novo sphingolipid biosynthesis in cultured neurons in situ［J］.J Biol Chem，1993，268（36）：27299－27306.

［12］ Humpf HU，Schmelz EM，Meredith FI，et al.Acylation of naturally occurring and synthetic 1-deoxysphinganines by ceramide synthase.Formation of N-palmitoyl-aminopentol produces a toxicmetabolite of hydrolyzed fumonisin，AP1，and a new category of ceramide synthase inhibitor［J］.JBiol Chem，1998，273（30）：19060－19064.

［13］ 唐寧，金潔，鄧云，等.人源性長壽保障基因2通過與V-ATPase作用抑制肝癌細胞的生長［J］.生理學報，2010，62（3）：196－202.

［14］ Chung Y，Fu E.Crosstalk between Shh and TGF-βsignaling in cyclosporine-enhanced cell proliferation in human gingival fibroblasts［J］.PLoS One，2013，8（7）：e70128.

［15］ Yin LM，Jiang HF，Wang X，et al.Effects of sodium copper chlorophyllin on mesenchymal stem cell function in aplastic anemiamice［J］.Chin J Integr Med，2013，19（5）：360－366.

［16］ Liu R，Li J，Teng Z，et al.Overexpressed microRNA-182 promotes proliferation and invasion in prostate canc-er PC-3 cells by down-regulating N-myc downstream regulated gene 1（NDRG1）［J］.PLoS One，2013，8（7）：e68982.

［17］ Zotes TM，Arias CF，Fuster JJ，et al.PI3K p110γdeletion attenuatesmurine atherosclerosis by reducingmacrophage proliferation but not polarization or apoptosis in lesions［J］.PLoSOne，2013，8（8）：e72674.

［18］ Dzieran J，Fabian J，Feng T，et al.Comparative analysis of TGF-β／Smad signaling dependent cytostasis in human hepatocellular carcinoma cell lines［J］.PLoSOne，2013，8（8）：e72252.

［19］ Halder SK，Beauchamp RD，Datta PK.A specific in

hibitor of TGF-βreceptor kinase，SB-431542，as a potent antitumor agent for human cancers［J］.Neoplasia， 2005，7（5）：509－521.

［20］ Zhang L，Zhou F，Ten Dijke P.Signaling interplay between transforming growth factor-βreceptor and PI3K／AKT pathways in cancer［J］.Trends Biochem Sci，2013，38（12）：612－620.

［21］ Katz LH，Li Y，Chen JS，etal.Targeting TGF-βsignaling in cancer［J］.Expert Opin Ther Targets，2013，17（7）：743－760.

［22］ Matsubara T，Tanaka N，Patterson AD，et al.Lithocholic acid disrupts phospholipid and sphingolipid homeostasis leading to cholestasis in mice［J］.Hepatology，2011，53（4）：1282－1293.

Fumonisin B1 promoted HepG2 cell proliferation by up-regulating TGF-βsignaling pathway

ZENG Tian-tian，LU Xiao-dong，CHEN Lu-fang，CHEN Yuan-yuan，SHAO Qi-xiang
（School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212003，China）

Objective：To investigate the influence of Fumonisin B1（FB1）on the proliferation of HepG2 cells and its possiblemechanism.M ethods：HepG2 cellswere cultured 48 h in prepared DMEM with different concentrations of0.5，1.0，10，50μmol／L FB1，themorphology of each group were observed under inverted microscope.Cell proliferation was evaluated by Cell Counting Kit8（CCK-8）assay.The mRNA expression levels of transforming growth factor-β1（TGF-β1），Drosophila mothers against decapentaplegic 4（Smad4）and plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）were detected by quantitative real-timePCR.Results：Microscope showed that cell division was increased in parallelwith the increase of FB1 concentration.CCK-8 assay revealed that cell proliferation was remarkably increased after treatment of FB1.In the 0.5 and 1.0μmol／L groups，mRNA expression of Smad4 and PAI-1 in HepG2 cells showed no significant difference compared with control group，while in the10 and 50μmol／L groupswere increased dramatically.Conclusion：FB1 could promote cell proliferation effectively，and the elevated level of TGF-β1，Smad4 and PAI-1 in TGF-βpathway may be one ofmechanisms for promoting cell proliferation in HepG2 cells.

Fumonisin B1；cell proliferation；transforming growth factor-β1；signaling pathway；HepG2 cells

R329.28；R979.1

A

1671－7783（2014）02－0114－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140008

曾甜甜（1986—），女，碩士研究生；盧小東（通訊作者），副教授，碩士生導師，E-mail：xiaodonglu2013＠163.com

2014－01－07 ［編輯］ 劉星星