Tet-off誘導表達Egr-1 HEK293穩定細胞株的建立和鑒定

彭琬昕，孟凡力，金潔，龔愛華

（1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院生物學系，江蘇鎮江212013；2.南京師范大學生命科學院，江蘇南京210023；3.南京醫科大學基礎醫學院，江蘇南京211166）

Tet-off誘導表達Egr-1 HEK293穩定細胞株的建立和鑒定

彭琬昕1，2，孟凡力2，3，金潔1，龔愛華1

（1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院生物學系，江蘇鎮江212013；2.南京師范大學生命科學院，江蘇南京210023；3.南京醫科大學基礎醫學院，江蘇南京211166）

目的：利用大腸埃希菌Tet-off誘導表達調控系統構建多西環素調控的穩定細胞株。方法：以pEGFPEgr-1質粒為模板，擴增含早期生長反應蛋白（early growth response-1，Egr-1）完整開放閱讀框的DNA序列，經酶切后插入含四環素反應元件（tetracycline responsive element，TRE）序列的表達載體pTRE2hyg，獲得重組質粒pTRE2hyg-Egr-1，將其轉染293Tet-off細胞株，并用G418和多西環素篩選穩定表達Egr-1的細胞株。蛋白質印跡法檢測多西環素誘導表達Egr-1情況；流式細胞術檢測細胞增殖能力。結果：蛋白質印跡結果顯示，外源性Egr-1蛋白表達受細胞培養液中多西環素調控，當從細胞培養液中去除多西環素后，Egr-1表達量明顯升高。流式細胞檢測結果顯示Egr-1高表達細胞的增殖能力明顯高于Egr-1低表達細胞。結論：利用Tet-off體系成功構建Egr-1誘導表達的細胞株，細胞的增殖能力受Egr-1表達水平的影響。

Tet-off調控系統；早期生長反應蛋白1；穩定細胞株；多西環素

早期生長反應蛋白1（early growth response-1，Egr-1）是具有鋅指結構的核磷酸蛋白，能在多種內、外界刺激下迅速表達，例如促有絲分裂原、生長因子、紫外線照射以及損傷等［1］。目前已證實Egr-1參與胚胎發育、細胞生長增殖、分化以及凋亡等多種細胞事件，多種疾病如炎癥及心血管疾病等與其異常表達相關［2－5］。因此，研究Egr-1在細胞中對下游基因的調控機制，可以為多種疾病的基因治療提供理論靶點。本研究旨在利用Tet-off誘導調控系統建立多西環素調控Egr-1基因表達的293穩定細胞株，為研究Egr-1蛋白功能及其下游信號通路的調控機制提供一種有價值的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

Tet-off誘導表達系統（Clontech公司）及穩定表達Tet-off質粒的HEK293細胞系（以下稱293Tet-off細胞系）由南京大學李朝軍教授實驗室饋贈。Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶CalⅠ、SalⅠ、CIAP堿性磷酸酶購自TaKaRa公司。DNA片段回收試劑盒、DNA片段PCR純化試劑盒購自Axygen公司，多西環素和潮霉素B購自Calbiochem公司，一抗Egr-1和β-肌動蛋白購自Santa Cruz公司，羊抗兔HRP二抗購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 pTRE2hyg-Egr-1引物設計和目的基因擴增

以已構建的pEGFP-Egr-1質粒為模板，擴增含Egr-1完整開放閱讀框的DNA序列。上游引物序列為5′-CCATCGAT（ClaⅠ）ATGGCCGCGGCCAAGGCCGAG-3′；下游引物：5′-CGGAATTC（SalⅠ）TATGGTGGGATGGTGAGGCA-3′。反應條件：96℃5 min預變性，94℃45 s，65℃45 s，72℃120 s，循環30次，最后再72℃延伸7 min。

1.2.2 重組反應質粒pTRE2hyg-Egr-1的構建、克隆、篩選 PCR產物和含四環素反應元件（tetracycline responsive element，TRE）序列的pTRE2hyg載體使用CalⅠ和SalⅠ分步酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳割膠回收，純化DNA。目的基因Egr-1與含相應黏性末端的pTRE2hyg連接。

反應體系10μL，含10×T4DNA連接酶緩沖液1μL，T4DNA連接酶1 IU，目的基因片段和載體片段按摩爾比3∶1于16℃連接反應20 h。連接產物10μL轉化入100μL感受態細菌DH5α，經氨芐西林培養基篩選，重組質粒用雙酶切或PCR鑒定后測序分析。

1.2.3 多西環素抑制EGR-1基因表達的最佳濃度測定 293Tet-off細胞株培養于含10%胎牛血清的DMEM中，在37℃，含5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。將培養的293Tet-off細胞系接種于6孔板中，培養至細胞密度達60%～70%，按Lipofectamine 2000說明書步驟轉染pTRE2hyg-Egr-1重組質粒入細胞，孵育6 h后去除含脂質體復合物的培養基，于37°C、5%CO2培養24 h后進行相關實驗。

按照0，0.5，1，2，4，10，100μg／mL設定多西環素的質量濃度梯度，分別處理轉染了pTRE2hyg-Egr-1質粒24 h后的293Tet-off細胞株，同時將未轉染pTRE2hyg-Egr-1質粒的293Tet-off細胞作為陰性對照。藥物處理48 h之后，RAPI裂解細胞，提取總蛋白。每孔蛋白上樣量30μg，蛋白質印跡法檢測Egr-1蛋白的表達情況，選擇多西環素抑制Egr-1表達的最佳濃度。

1.2.4 穩定細胞株的篩選 將293Tet-off細胞接種至60 mm培養皿中，至密度為70%時轉染pTRE2hyg-Egr-1質粒。消化細胞接種至2個10 cm細胞培養皿，用含200μg／mL G418、10%胎牛血清的DMEM繼續培養。48 h后，添加潮霉素B至終質量濃度為100μg／mL，每兩天換一次液，得到的穩定細胞株命名為293Tet-off-Egr-1。

2 結果

2.1 重組表達載體的構建及酶切鑒定

人Egr-1全長cDNA以正確的讀碼框插入表達載體pTRE2hyg中，獲得重組質粒pTRE2hyg-Egr-1，質粒經ClaⅠ、SalⅠ雙酶切得到約1 600 bp的片段（圖1），同預期的結果相一致。挑取單個菌落送上海生工生物公司進行序列測序，結果完全正確。

圖1 重組表達載體pTRE2hyg-Egr-1酶切鑒定

2.2 多西環素負調控Egr-1蛋白表達的測定

將不同質量濃度多西環素（0、0.5、1、2、4、10、100μg／mL）處理的293Tet-off-Egr-1細胞以及293Tet-off對照組細胞裂解液加入6×上樣緩沖液，10%SDSPAGE電泳，轉至PVDF上，檢測Egr-1蛋白表達，以β-肌動蛋白作為內參。實驗結果顯示（圖2），在80 000左右位置檢測到Egr-1蛋白，培養液中未加多西環素時（0μg／mL），293Tet-off-Egr-1細胞能有效表達外源性Egr-1蛋白；隨著濃度的加大，多西環素對Egr-1表達的抑制作用逐漸增強。當多西環素的濃度達到10μg／mL時，與未加多西環素處理組相比，Egr-1水平明顯降低。

圖2 蛋白質印跡法檢測293Tet-off-Egr-1細胞中Egr-1蛋白的表達

2.3 Egr-1對細胞增殖能力的影響

利用我們建立的293Tet-off-Egr-1細胞模型檢測Egr-1不同表達量情況下細胞周期的變化情況。結果顯示，Egr-1高表達的293Tet-off-Egr-1細胞（0、1μg／mL多西環素處理組）S期細胞所占的比例明顯高于加入了20μg／mL多西環素的細胞組（圖3）。

圖3 不同濃度多西環素處理后細胞周期的變化

3 討論

Tet-off誘導表達系統是20世紀90年代以來Gossen等［6－8］利用大腸埃希菌轉座子Tn10四環素抗性操縱子創建的一種高效、嚴密并特異地控制外源基因表達的體系。通過加入四環素或其衍生物多西環素能抑制目的基因的表達，而在去除培養基中的四環霉素或多西環素后目的基因的表達被激活［9］。隨著細胞培養基中四環素或多西環素減少，外源基因表達逐漸增加，且表達按照一種劑量依賴方式受四環素或者多西環素精準調控［10］。Tet-off系統主要包括2個部分，即調節質粒和反應質粒。調節質粒可以表達一種融合蛋白，稱為四環素反應轉錄活化因子（tTA）；反應質粒含有四環素反應元件［11］。本實驗中，我們將Egr-1基因插入pTRE載體中反應原件TRE的下游，并將該重組質粒轉染含有pTet-off基因的293穩定細胞株，得到受四環素及其衍生物多西環素調控Egr-1蛋白表達的穩定細胞株293Tet-off-Egr-1。

Egr-1又稱NFGI-A、Zif268、Krox24和TIS8等，能被一系列生長因子、細胞因子和損傷刺激迅速而瞬時地誘導表達［12－13］。Egr-1參與多種細胞進程，其中包括血管發生、腫瘤發生、缺血應激、損傷愈合和一些血管疾病［14－15］。Egr-1在體內正常組織和細胞中表達極低，甚至不表達；而在生長活躍器官或組織的細胞中表達明顯增多。已有文獻報道，Egr-1通過直接或間接地參與細胞增殖、凋亡、分化等過程，在腫瘤形成和心血管、肺臟、腎臟等系統的疾病中發揮重要作用［16－17］。

本實驗中我們成功構建了Tet-off基因表達系統反應質粒pTRE2hyg-Egr-1。初步結果顯示，反應質粒pTRE2hyg-Egr-1轉染至293Tet-off細胞后，在多西環素的存在下，Egr-1蛋白表達水平隨多西環素質量濃度升高而下調。與未加多西環素處理的對照組相比，實驗組Egr-1表達量明顯下降。流式細胞檢測結果顯示，在不同濃度多西環素存在情況下，隨著Egr-1表達量的不同，293Tet-off細胞的周期發生明顯改變，證明該細胞株可以作為研究Egr-1對細胞行為調控作用的實驗工具。

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Establishment and detection of a Tet-off stable cell line expressing Egr-1 protein regulated by doxycycline

PENGWan-xin1，2，MENG Fan-li2，3，JIN Jie1，GONG Ai-hua1
（1.Department of Biology，School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.School of life science，Nanjing Normal University，Nanjing Jiangsu 210023；3.School of Basic Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 211166，China）

Objective：To construct the responsive plasmid of pTRE2hyg-Egr-1 Tet-off gene expression system and examine its expression.M ethods：PCR was performed to obtain the cDNA of early growth response-1（Egr-1）which was inserted into the responsive plasmid PTRE2hyg.DNA sequencing was performed after the recombinant of responsive plasmid pTRE2hyg-Egr-1 was identified by sequencing.This recombinant vector was transfected into 293Tet-offcells by means of liposome and its expression was examined by Western blotting under the control of deoxycycline.Results：The responsive plasmid pTRE2hyg-Egr-1 verified by sequencing，was capable of expression in 293Tet-offcould be controlled by deoxycycline concentration.Conclusion：The responsive plasmid pTRE2hyg-Egr-1 of Tet-off expression system was constructed successfully，and it can express under the regulation of deoxycycline in the 293Tet-offcells.

Tet-off inducible gene expression system；early growth response-1；stable cell line；doxycycline

R329.28

A

1671－7783（2014）02－0118－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140046

國家自然科學基金資助項目（31100964）

彭琬昕（1982—），女，安徽合肥人，講師，主要從事腫瘤細胞生物學研究。

2014－03－04 ［編輯］陳海林