Bcl-6基因3′UTR雙熒光素酶報告質粒的構建及其與miR-346靶向關系的驗證

陳娟，袁靖，吳晶晶，田潔，湯新逸，芮棵，田新宇，張悅，劉海冰，耿麗娜，楊珺，許化溪，王勝軍

（江蘇大學檢驗醫學研究所，江蘇鎮江212013）

Bcl-6基因3′UTR雙熒光素酶報告質粒的構建及其與miR-346靶向關系的驗證

陳娟，袁靖，吳晶晶，田潔，湯新逸，芮棵，田新宇，張悅，劉海冰，耿麗娜，楊珺，許化溪，王勝軍

（江蘇大學檢驗醫學研究所，江蘇鎮江212013）

目的：構建Bcl-6基因3′非編碼區（3′untranslated region，3′UTR）熒光素酶報告質粒，分析miR-346對Bcl-6的調控作用。方法：通過PicTar數據庫和miRanda數據庫預測可能與Bcl-6基因3′UTR作用的miRNA；將人工合成的Bcl-6基因3′UTR區序列克隆至熒光素酶報告質粒psiCHECK-2；將重組熒光素酶報告質粒和miRNAmimics共轉染293T細胞，用雙熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性。結果：PicTar數據庫和miRanda數據庫預測交叉結果顯示，miR-346與Bcl-6基因3′UTR存在互補結合位點；構建的熒光素酶報告質粒經酶切及測序鑒定正確；重組質粒和miR-346 mimics共轉染293T細胞后，熒光素酶報告質粒表達的熒光素酶活性降低66%左右。結論：成功構建了Bcl-6基因3′UTR熒光素酶報告質粒，篩選出和Bcl-6表達相關的miRNA即miR-346。

Bcl-6基因；微小RNA；3′非編碼區；熒光素酶報告質粒

B細胞淋巴瘤因子-6（B cell lymphoma 6，Bcl-6）是一種轉錄抑制因子［1－3］，最初發現它是調節生發中心B細胞分化的主要因子［2］。Bcl-6通過調節細胞周期相關基因、DNA損傷反應相關基因以及抑制大量的信號通路，包括B細胞受體信號，來控制生發中心B細胞的分化［2－4］。近年來發現Bcl-6也可以調控濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cells，Tfh）的分化發育。在體內，組成性的過表達Bcl-6可以促使Tfh細胞分化，已分化的Tfh細胞表達高水平的Bcl-6［1，5－6］。微小RNA（miRNA）參與生物體的生長、發育、凋亡等調控，其機制主要是根據核酸序列的互補性，miRNA結合到特定靶mRNA的3′非編碼區（3′untranslated region，3′UTR），通過調節靶mRNA的翻譯或者直接降解靶mRNA來調控目標基因蛋白水平的表達［7］。有關miRNA的異常表達與疾病發生發展的關系引起學者們的極大關注，最初miRNA的研究主要集中在腫瘤方面，近幾年，越來越多的研究發現miRNA與多種自身免疫性疾病的發展密切相關［8－9］。本研究通過生物信息學預測可能調控免疫相關分子Bcl-6表達的miRNA，并構建Bcl-6基因3′UTR熒光素酶報告載體，通過共轉染實驗檢測Bcl-6基因和miRNA的靶向關系。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎胚293T細胞、感受態大腸埃希菌DH5α（本實驗室保存）。DMEM高糖培養基和胎牛血清（Gibco公司），無RNA酶離心管和槍頭（Axygen公司），miR-346 mimics及陰性對照購于廣州銳博生物技術有限公司，LipofectamineTM2000轉染試劑（Invitrogen公司），限制性內切酶NotⅠ及XhoⅠ（TaKaRa公司），熒光素酶報告質粒psiCHECK-2（Promega公司），DNA連接試劑盒（TaKaRa公司），質粒DNA小量提取試劑盒（Generay公司），雙熒光素酶報告基因檢測系統（Promega公司）。

倒置顯微鏡（奧林巴斯公司），超凈工作臺（蘇州尚田潔凈有限公司），低溫臺式高速離心機和移液器（Eppendorf公司），CO2恒溫細胞培養箱（Forma公司），化學發光分析儀（Berthold公司）。

采用以下兩種預測軟件：miRanda（http：／／www.microrna.org），PicTar（http：／／pictar.mdc-berlin.de）

1.2 方法

1.2.1 靶基因預測 采用miRanda和PicTar兩個數據庫檢索Bcl-6，預測可能靶向作用于Bcl-6的miRNA，預測結果取交集，評分高者優先，并結合文獻中報道的與自身免疫病相關的miRNA作為進一步篩選的條件。

1.2.2 熒光素酶報告載體的構建 從基因庫中獲得Bcl-6基因3′UTR序列（基因號NM＿001706），設計并合成位于Bcl-6基因3′UTR區涵蓋miR-346兩個作用位點的一段序列，分別在5′加上XhoⅠ內切酶，3′加NotⅠ內切酶。由上海生工生物有限公司合成，長152 bp，連接于pUC57載體上。具體序列：5′-CTCGAGGAATCTACCCAAAGGATACTGTAACACTTTACAGCTCGATTTTGTATCTGCAGGCAGACACGGATCTGAGAATCTTTATTGAGAAAGAGCACTTAAGAGTGCACCATCCCTTTTTGAAGTGTAGGCAGACACAGGGACGCGGCCGC-3′。雙酶切連有目的片段的pUC57質粒和psiCHECK-2空載，回收152 bp目的片段和psiCHECK-2載體片段，T4DNA連接酶16℃連接過夜。將連接產物轉化至感受態大腸埃希菌DH5α中，挑選陽性單菌落搖菌，提取質粒，進行雙酶切（XhoⅠ／NotⅠ）鑒定。鑒定正確后的質粒命名psiCHECK-3′UTR，并送上海英駿生物技術公司測序。

1.2.3 細胞培養 人腎胚293T細胞加入到含10%胎牛血清（FBS）的DMEM，置于37℃恒溫、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。

1.2.4 瞬時轉染 miRNA mimics及陰性對照凍干粉離心后分別根據miRNA產品使用說明書要求，用相應量的DEPC水溶解。使用24孔培養板，于轉染前1天接種適當數目的293T細胞至板中，每孔中加入不含抗生素的培養基，使轉染時的細胞密度能夠達到30%～50%。參照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。實驗共分4組，分別為psi-CHECK-2空載與陰性對照，psiCHECK-2空載與miR-346 mimic，psiCHECK-3′UTR與陰性對照，psi-CHECK-3′UTR與miR-346 mimic。每組設3個平行孔，以psiCHECK-2空載與陰性對照組作為陰性對照，實驗重復3次。轉染后48 h時裂解細胞，檢測熒光素酶活性。

1.2.5 熒光素酶活性測定 除去細胞中的培養基，用PBS緩沖液洗滌細胞1次。將1×PLB 100μL加入到24孔培養板中，室溫輕緩晃動培養板15 min，將裂解液轉移到檢測試管中。事先在檢測管中加入100μL LARⅡ，設置熒光發光儀程序。轉移20μL PLB裂解液到檢測管中，混合，檢測螢火蟲熒光素酶的活性，向檢測管中加入100μL Stop＆Glo?試劑，檢測海腎熒光素酶活性。

2 結果

2.1 靶向關系預測

以Bcl-6為目的基因，經過miRanda和PicTar兩個數據庫預測交叉結果顯示，miR-346在兩個數據庫中均評分最高，靶向作用于Bcl-6的可能性最大。因此，選miR-346做進一步的研究。圖1為數據庫預測出的miR-346與Bcl-6 3′UTR作用的位點。

圖1 m iR-346與Bcl-6 3′UTR作用的位點

2.2 熒光素酶報告質粒的構建與鑒定

設計并合成位于Bcl-6基因3′UTR區涵蓋miR-346兩個作用位點的一段序列，分別在5′加上XhoⅠ內切酶，3′加上NotⅠ內切酶，將目的基因與psi-CHECK-2載體連接后，轉化大腸埃希菌得到重組質粒，雙酶切法鑒定陽性克隆，可觀察到與目的片段152 bp相符的條帶（圖2），由上海英駿生物技術公司測序后證實與設計合成的序列完全吻合。

圖2 psiCHECK-3′UTR重組質粒雙酶切鑒定

2.3 轉染重組質粒的細胞熒光素酶的表達

將miR-346 mimics與psiCHECK-3′UTR重組質粒共轉染入293T細胞中，以psiCHECK-2空載體和陰性對照組作為陰性對照，測定各組細胞熒光素酶活性，所有實驗均重復2次。如果miRNA與對應的靶基因相互作用，則表現為細胞熒光素酶活性下降。圖3顯示，miR-346對psiCHECK-3′UTR重組質粒的熒光素酶表達有比較明顯的抑制作用，熒光素酶活性降低66%左右。說明miR-346通過與Bcl-6的3′UTR相互作用，抑制Bcl-6蛋白水平的表達。

圖3 各組轉染后細胞的熒光素酶表達情況

3 討論

Bcl-6基因最初是研究非霍奇金淋巴瘤免疫基因圖譜時發現的一種原癌基因［10］，屬于轉錄抑制蛋白，能結合到靶基因DNA序列上抑制含有識別位點的靶基因的轉錄。Bcl-6主要表達于生發中心的B細胞和CD4＋T細胞，參與淋巴細胞分化、控制生發中心形成和調節T細胞依賴的抗原反應。受Bcl-6調控的基因包括blimp-1、CD44、細胞周期蛋白D2、IP-10等［11－12］。研究發現，Bcl-6過表達會使生發中心內的B細胞不能按正常途徑發育成熟，最終導致腫瘤發生。

miRNA是近年來發現的一種小分子非編碼RNA，廣泛存在于病毒、植物以及動物體內，參與生物體的生長、發育、凋亡等調控。成熟miRNA通過識別靶mRNA的3′UTR區，降解靶基因或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質的合成，達到調控基因表達的目的［7］。生物信息學預測，約1／3的mRNA受miRNA調控。一個miRNA可作用于多個靶基因，多個miRNA也可以共同調控同一個靶基因。目前，已發現的人miRNA有700多個，免疫細胞中表達100多種miRNA，這些miRNA在固有免疫及適應性免疫中均發揮著重要作用［8－9］。

本實驗首先采用miRanda和PicTar兩個數據庫預測了可能與免疫相關分子Bcl-6相互作用的miRNA，篩選出miR-346作為進一步研究對象。然后通過構建Bcl-6 3′UTR雙熒光素酶報告質粒以及與miR-346 mimics共轉染293T細胞，檢測熒光素酶活性的變化，證實miR-346可以靶向作用于Bcl-6基因，調控其蛋白水平表達。

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Construction of Bcl-6 gene 3′UTR dual luciferase reporter vector and targeting verification between Bcl-6 and m iR-346

CHEN Juan，YUAN Jing，WU Jing-jing，TIAN Jie，TANG Xin-yi，RUIKe，TIAN Xin-yu，ZHANG Yue，LIU Hai-bing，GENG Li-na，YANG Jun，XU Hua-xi，WANG Sheng-jun
（Institution of Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To construct a luciferase reporter vector containing the 3′untranslated region（3′UTR）of Bcl-6 gene andmeasure the correlation between Bcl-6 andmiR-346.M ethods：ThemiRNA targeting Bcl-6 3′UTR was predicted bymiRanda and PicTar.The synthetic 3′UTR fragmentof Bcl-6 was cloned into PsiCHECK-2 reporter vector.The luciferase reporter vector and miRNA mimics were transfected into 293T cells.The relative luciferase activity was detected.Results：PicTar andmiRanda database shared the results thatmiR-346 have the complementary binding siteswith 3′UTR of Bcl-6.Results of double enzyme digestion and DNA sequencing showed that sequence of luciferase reporter vector was correct.The luciferase activity of reporter vector treatingmiR-346 was decreased observably about66%.Conclusion：The luciferase reporter vector containing the 3′UTR of Bcl-6 was constructed successfully.

Bcl-6；microRNA；3′untranslated region；luciferase reporter vector

R561.4

A

1671－7783（2014）02－0122－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130121

國家自然科學基金資助項目（81072453，31170849，30972748）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK2011472）；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目（CXLX11＿0608）；江蘇省衛生廳醫學科研基金資助項目（Z201313）；江蘇省“青藍工程”項目（蘇教師［2010］27號）

陳娟（1988—），女，碩士研究生；王勝軍（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：sjwjs＠mail.ujs.edu.cn

2013－06－04 ［編輯］陳海林