HPLC法同時測定金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量

易承學，童珊珊，徐希明，余江南

（1.鎮江市疾病預防控制中心檢驗科，江蘇鎮江212004；2.江蘇大學藥學院，江蘇鎮江212013）

HPLC法同時測定金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量

易承學1，2，童珊珊2，徐希明2，余江南2

（1.鎮江市疾病預防控制中心檢驗科，江蘇鎮江212004；2.江蘇大學藥學院，江蘇鎮江212013）

目的：建立高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法同時測定金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇含量。方法：采用Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱同時測定上述2種成分，流動相為甲醇，流速1.0 mL·min－1，檢測波長為282 nm，柱溫25℃。結果：麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的進樣量在0.025～1.5μg范圍內呈良好線性關系（r＝0.999 9）；平均回收率（n＝6）分別為104.6%［相對標準偏差（RSD）＝0.89%］，103.5%（RSD＝3.34%）。結論：該方法簡便，快速，準確，適用于測定金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量。

金針菇；麥角甾醇；22，23-二氫麥角甾醇；高效液相色譜法

金針菇（Flammulina velutipes），又名金錢菌、樸菇、冬菇、毛柄金錢菌，屬真菌門（Eumycota），擔子菌亞門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae），小火焰菌屬（Flammulina）或金錢菌屬（Collybia），營養價值和藥用價值均較高，是中外著名的食用菌之一［1］。其蛋白質、多糖和糖蛋白具有抗腫瘤、抗病毒和調節免疫等生物活性，均已被分離出［2－3］。此外，還發現一些麥角甾烷類和豆甾烷類化合物，其中，麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇含量最高［4］。麥角甾醇是真菌類的特征甾醇，具有抗腫瘤、利尿作用［5－6］，同時，也是一些中藥及中藥制劑的指標性成分［7－8］。22，23-二氫麥角甾醇經紫外線照射后可以轉化為維生素D4，后者在動物體組織內的分布狀況與D3相似，但排泄速度較D3快，在高劑量作用下毒性更低［9］。

麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇在金針菇中含量較高，故可作為金針菇的質量控制指標之一。麥角甾醇的測定方法有UV法［10］、TLC法［11］、HPLCUV法［7－8］和GC法［12］等，而目前尚未見有關同時測定金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的報道。本實驗擬建立一種高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析方法，同時測定上述兩種成分。

1 儀器與試劑

Shimadzu高效液相色譜儀（包括LC-20AT泵，SPD-20A紫外檢測器，N2000色譜工作站）；ALC-110.4電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；麥角甾醇對照品（Acros Organics，純度98%，批號A0279702），22，23-二氫麥角甾醇對照品（自制，結構經光譜方法鑒定，純度＞98%）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；金針菇（鎮江正東菇業有限公司提供）于55℃鼓風干燥備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇，流速1.0 mL·min－1，檢測波長為282 nm，柱溫25℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品麥角甾醇15.16 mg和22，23-二氫麥角甾醇15.26 mg，分別置于25 mL量瓶中，甲醇溶解后定容至刻度，配制成對照品母液。經逐步定量稀釋，制成含麥角甾醇為1.213，4.851，24.256，48.512，72.768μg·mL－1和22，23-二氫麥角甾醇為1.221，4.883，24.416，48.832，73.248μg·mL－1的系列混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取過100目篩的金針菇細粉0.3 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱重，超聲（功率500 W，頻率40 KHz）處理30 min，冷卻至室溫，再稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性實驗 分別取對照品溶液、供試品溶液各20μL，利用液相色譜儀測定，記錄色譜圖，見圖1。由圖可見，該色譜條件下，麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數均不低于6 000。

圖1 對照品和金針菇的HPLC色譜圖

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”中系列對照品溶液各20μL注入液相色譜儀進行測定。以峰面積Y為縱坐標，對照品進樣量X（μg）為橫坐標，進行回歸分析，求得麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇線性回歸方程分別為Y＝706 730X＋637.72，r＝0.999 9；Y＝579 038X＋137 9，r＝0.999 9，線性范圍為0.025～1.5μg。

2.3.3 精密度實驗 精密吸取對照品溶液20μL，連續進樣5次，測定峰面積值。計算麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇峰面積的相對標準偏差（RSD）（n＝5）分別為0.25%和0.55%，說明儀器性能良好。

2.3.4 重復性實驗 精密稱取同一批金針菇粉末樣品6份，制備供試品溶液，進行測定。計算麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇含量平均值（n＝6）分別為0.30%，0.072%；RSD分別為0.29%，0.78%。說明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性實驗 取同一供試品溶液，25℃室溫下放置，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定，計算麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇峰面積的RSD（n＝6）分別為0.76%和1.46%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.6 加樣回收率實驗 取已知麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇含量金針菇粉末樣品（分別為0.30%和0.072%）6份，每份0.3 g，精密稱定，分別精密加入各對照品適量（與0.3 g樣品中各待測成分的量相當），按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，依法測定，計算回收率。麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇峰的平均加樣回收率（n＝6）分別為104.6%，103.5%；RSD分別為0.89%，3.34%。

2.3.7 樣品含量測定 分別精密稱取不同批次生產的金針菇細粉約0.3 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進行色譜測定，以外標法計算含量，結果見表1。

3 討論

3.1 藥材提取方法

本實驗分別考察了索氏加熱回流提取6、10 h

表1 不同批次金針菇樣品中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量 %，n＝2

和超聲提取10，20，30，40，60 min對樣品中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇提出率的影響。結果顯示，超聲30 min與索氏加熱提取無明顯差別，故選擇操作方法相對簡便的超聲30 min的提取方法。結果見表2。

表2 不同提取方法測定麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量 %，n＝2

3.2 流動相選擇

在100%甲醇的條件下，甾醇峰形尖銳對稱，保留時間合適，2種成分均能與雜質達到很好分離。增加水的比例后發現峰形變寬，保留時間明顯延長，故確定100%甲醇作為流動相。

3.3 結果分析

從表1知，不同批次生產的金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇含量變化不大，充分體現出食用菌工廠化生產不受外界自然條件影響，產品質量穩定可控的獨特優勢。本文建立的HPLC法，適合同時檢測金針菇中上述2種成分。

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High performance liquid chromatography for simultaneous determ ination of ergosterol and 22，23-dihydroergosterol in Flammulina velutipes

YICheng-xue1，2，TONG Shan-shan2，XU Xi-ming2，YU Jiang-nan2
（1.Departmentof Clinical Laboratory，Zhenjiang Center for Disease Control and Prevention，Zhenjiang Jiangsu 212004；2.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To develop an efficient high performance liquid chromatography（HPLC）method for the simultaneous determination of ergosterol and 22，23-dihydroergosterol in Flammulina velutipes.M ethods：Chromatographic separation was achieved on an Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5μm）analytical column using amobile phase of 100%methanol at1.0 mL·min－1.The sterol contentwas detected at282 nm.The temperature of column was25℃.Results：The established linearity range for ergosterol and 22，23-dihydroergosterol was 0.025－1.5μg（r＝0.999 9）.The average recoveries（n＝6）were 104.6%with RSD 0.89%，103.5%with RSD 3.34%，respectively.Conclusion：The established HPLCmethod was simple，rapid and reliable for the separation and simultaneous determination of ergosterol and 22，23-dihydroergosterol in Flammulina velutipes.

Flammulina velutipes；ergosterol；22，23-dihydroergosterol；high performance liquid chromatography

R917

A

1671－7783（2014）02－0126－03

10.13312／j.issn.1671-7783.y130281

國家自然科學基金資助項目（30973677）；教育部博士點基金資助項目（20113227110012）

易承學（1983—），男，湖南衡陽人，主管技師，博士；余江南（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：yjn＠ujs.edu.cn

2014－01－01 ［編輯］ 劉星星