肺腺癌轉移相關轉錄子-1和核因子-κB在食管鱗癌組織中的表達及其相關性

尹越，張曌玥，牟笑，吳詩，毛朝明，陳德玉

（1.江蘇大學臨床醫學院，江蘇鎮江212001；2.江蘇大學附屬醫院腫瘤研究院，江蘇鎮江212001）

肺腺癌轉移相關轉錄子-1和核因子-κB在食管鱗癌組織中的表達及其相關性

尹越1，張曌玥1，牟笑1，吳詩1，毛朝明2，陳德玉2

（1.江蘇大學臨床醫學院，江蘇鎮江212001；2.江蘇大學附屬醫院腫瘤研究院，江蘇鎮江212001）

目的：研究肺腺癌轉移相關轉錄子-1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT-1）和核因子-κB（NF-κB）在食管鱗狀細胞癌（鱗癌）組織中的表達及其相關性。方法：采用qRT-PCR技術檢測60例食管鱗癌組織和癌旁組織中MALAT-1和NF-κB的mRNA水平的表達，免疫組化SP方法檢測NF-κB的蛋白表達水平。統計分析MALAT-1及NF-κB與患者臨床病理特征之間的關系以及兩者的相關性。結果：MALAT-1和NF-κB mRNA在60例食管鱗癌組織中的表達均高于癌旁組織（Z＝－3.600，P＜0.001；Z＝－2.856，P＜0.05），且NF-κB蛋白在食管鱗癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織（χ2＝36.39，P＜0.001）。MALAT-1、NF-κB的表達均與食管鱗癌的分化程度、淋巴結轉移以及TNM分期密切相關（P＜0.05）。MALAT-1與NF-κB之間存在正相關（r＝0.795，P＜0.001）。結論：長鏈非編碼RNA MALAT-1可能在食管鱗癌的發生發展中發揮重要作用。

肺腺癌轉移相關轉錄子-1；核因子-κB；食管鱗狀細胞癌；臨床病理特征

食管癌死亡率居于全球惡性腫瘤致死率第6位［1］。其發生與發展是多因素的復雜過程，在分子水平上涉及眾多基因及蛋白質的改變，甚至部分RNA的變化。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉錄本長度超過200 bp的非編碼RNA，本身并不參與編碼蛋白質，而是在基因表觀遺傳學修飾、蛋白質的轉錄與翻譯等多層面發揮調控作用［2］。最新研究發現肺腺癌轉移相關轉錄子-1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）作為lncRNA家族中的一員，在腦、骨髓、食管、膽囊、卵巢等組織的惡性腫瘤中均出現升高［3］。現有資料表明，lncRNA還參與多種腫瘤的轉移、侵襲、凋亡等過程［4－5］。但是，對于MALAT-1在食管癌中的作用機制和生物學功能尚不清楚。本實驗采用qRT-PCR技術檢測60例食管鱗癌患者癌組織和癌旁組織中的MALAT-1和核因子-κB（NF-κB）的mRNA表達水平，采用免疫組化技術檢測NF-κB的蛋白表達水平，并分析兩者與患者臨床病理特征之間的關系以及兩者之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集江蘇大學附屬醫院胸外科2012年1月至2013年11月60例食管鱗癌患者的新鮮手術標本，術后經病理證實為食管鱗癌。癌旁組織選取距離腫塊邊緣5 cm的正常組織。術前未行放化療。組織取出后立即置入－80℃冰箱凍存。研究過程嚴格遵循江蘇大學醫學院醫學倫理委員會關于人體試驗的倫理學標準并均獲得入選對象的知情同意。

1.2 MALAT-1和NF-κB的qRT-PCR

采用Trizol試劑提取標本的總RNA。按照反轉錄試劑盒的說明，使用10μL反應體系進行cDNA的合成。并使用25μL體系進行PCR反應。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。所有引物序列如下，MALAT-1上游引物：5′-ACTACTTTTTGCCTCCCTCACA-3′，下游引物：5′-AACTTATCTGCGGTTTCCTCAA-3′，產物長度為174 bp。NF-κB上游引物：5′-GGAGCACAGATACCACCAAGA-3′，下游引物：5′-CGCTTCTTCACACACTGGATT-3′，產物長度為223 bp。GAPDH上游引物：5′-TCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物：5′-TGGGTGGAATCAT-ATTGGAAC-3′，產物長度為136 bp。

1.3 NF-κB的免疫組織化學染色

采用鏈霉菌抗生物素蛋白 過氧化物酶連結（SP）法。對60例食管鱗癌組織依次進行低聚甲醛固定、石蠟包埋、連續切片，常規脫蠟、水化，抗原修復，血清封閉；然后進行兔抗人NF-κB（p65／REAL）多克隆抗體4℃孵育過夜。采用即用型快捷免疫組化試劑盒中二抗，按照說明書操作，室溫孵育30 min，DAB顯色5～10 min，蘇木精復染，常規脫水、透明、干燥、封片，光鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。

結果判定：NF-κB免疫組化染色陽性產物主要定位于細胞質內，呈棕黃色。根據陽性細胞所占百分比，無明顯陽性反應細胞為陰性（－），陽性細胞百分率＜25%為弱陽性（＋），25%～75%為中等陽性（＋＋），＞75%為強陽性（＋＋＋）。

1.4 統計學處理

使用統計軟件SPSS 20.0進行統計分析。對于非正態分布，經Wilcoxon檢驗和Mann-Whitney U檢驗分析。對于正態分布使用t檢驗。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。MALAT-1與NF-κB的相對表達量（2－ΔΔCt）經log2正態性轉換后采用Pearson′s相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗癌組織和癌旁組織中MALAT-1和NF-κB的mRNA表達情況

MALAT-1和NF-κB擴增曲線良好，熔解曲線均為單峰，產物的特異性好（圖1）。將食管鱗癌組織和癌旁組織的PCR結果進行統計分析，顯示在食管鱗癌組織中MALAT-1和NF-κB的mRNA表達均高于癌旁組織（Z＝－3.600，P＜0.001；Z＝－2.856，P＜0.05）（圖2）。

2.2 NF-κB蛋白的免疫組化結果

在60例食管鱗癌組織中，NF-κB蛋白表達陰性12例，弱陽性32例，中等陽性16例，強陽性0例。而在相應的癌旁組織中NF-κB的蛋白表達陰性45例，弱陽性11例，中等陽性4例，強陽性0例。NF-κB在食管鱗癌癌組織中的陽性表達率（48／60）顯著高于癌旁組織（15／60）（χ2＝36.39，P＜0.001）。NF-κB免疫組化染色的陽性產物主要定位于細胞質，呈棕黃色（圖3）。

2.3 MALAT-1和NF-κB的mRNA表達與食管鱗癌臨床病理相關性分析

食管鱗癌組織和癌旁組織中MALAT-1和NF-κBmRNA水平的表達與患者的性別、年齡、腫瘤位置均無統計學意義（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移及TNM分期相關（P＜0.05）。見表1。

圖1 實時熒光定量PCR曲線

圖2 MALAT-1和NF-κB在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達

圖3 NF-κB免疫組化染色結果（SP法×400）

2.4 NF-κB蛋白表達與食管鱗癌臨床病理相關性分析

食管鱗癌組織中NF-κB蛋白水平的表達與患者的性別、年齡、腫瘤位置均無統計學意義（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移及TNM分期相關（P＜0.05）。見表2。

2.5 NF-κB與MALAT-1表達的相關性分析

將MALAT-1與NF-κB mRNA的相對表達量通過log2正態性轉換后，行Pearson′s相關性分析，發現MALAT-1與NF-κB在mRNA水平上存在正相關（r＝0.795，P＜0.001）。見圖4。此外MALAT-1在鱗癌組織中的表達與NF-κB蛋白水平的表達相關，NF-κB蛋白陽性組（48例）MALAT-1的相對表達量為0.017，高于NF-κB蛋白陰性組（12例）的0.006的表達量（t＝7.916，P＜0.001）。

圖4 MALAT-1和NF-κB m RNA表達的相關性

3 討論

MALAT-1作為lncRNA家族中的一員，其基因位于染色體11q13，而該區域又與腫瘤的發生密切相關［6］。同時，MALAT-1是首個被發現的與腫瘤轉移潛能相關的lncRNA［7］。近年研究顯示，MALAT-1與許多惡性腫瘤密切相關，并且參與了腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移和分化等多種生物學過程［5，8］。在小細胞肺癌中，MALAT-1與轉移密切相關［9］；在宮頸癌中，通過調控Caspase-3、Bax、Bcl-2等促進腫瘤的增殖［10］；MALAT-1還通過調控抑癌基因p53的表達參與到腫瘤的形成［11］；在前列腺癌中，MALAT-1通過參與細胞周期的調控來促進腫瘤細胞的增長、侵襲與擴散［12］。NF-κB作為一個重要的轉錄因子，參與了腫瘤發生發展過程中的多項調節，包括腫瘤的轉移、擴散增殖及抑制凋亡等［13］。例如凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2，侵襲轉移最直接最重要的基質金屬蛋白酶9等均為NF-κB的下游靶基因［14－16］。現有研究證實NF-κB在食管癌的發生發展中起了重要的作用［17－18］。

表1 MALAT-1和NF-κB的m RNA表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系

表2 NF-κB的蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系

本實驗結果表明在食管鱗癌組織中MALAT-1的mRNA表達水平高于癌旁組織，且與食管鱗癌的分化程度、淋巴結轉移、TNM分期相關。提示MALAT-1在食管鱗癌的發生發展中起作用。同時食管鱗癌組織中NF-κB的mRNA水平和蛋白水平的表達也均高于癌旁組織，而且NF-κB的mRNA水平和蛋白水平的表達也均與食管鱗癌的分化程度、淋巴結轉移、TNM分期相關。Pearson′s相關性分析后發現，MALAT-1和NF-κB間存在正相關關系，且NF-κB蛋白陽性組的MALAT-1的表達量高于陰性組。表明在食管鱗癌中，高表達的MALAT-1可能與同樣高表達的NF-κB相互作用，導致了食管鱗癌的發生。但是兩者間的調控與被調控機制并不清楚，下一步將通過體外細胞培養和轉染等實驗來進一步研究。

［1］ Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74－108.

［2］ Caley DP，Pink RC，Trujillano D，et al.Long noncoding RNAs，chromatin，and development［J］.Scientific World Journal，2010，10：90－102.

［3］ Gibb EA，Vucic EA，Enfield KS，et al.Human cancer long non-coding RNA transcriptomes［J］.PLoS One，2011，6（10）：e25915.

［4］ Feng J，Tian L，Sun Y，et al.Expression of long noncoding ribonucleic acid metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1 is correlated with progress and apoptosis of laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Head Neck Oncol，2012，4：46.

［5］ Ying L，Chen Q，Wang Y，et al.Upregulated MALAT-1 contributes to bladder cancer cell migration by inducing epithelial-to-mesenchymal transition［J］.Mol Biosyst，2012，8（9）：2289－2294.

［6］ BekriS，Adelaide J，Merscher S，etal.Detailedmap of a region commonly amplified at 11q13→q14 in human breast carcinoma［J］.Cytogenet Cell Genet，1997，79（1／2）：125－131.

［7］ Ji P，Diederichs S，WangW，etal.MALAT-1，a novel noncoding RNA，and thymosinβ4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer［J］.Oncogene，2003，22（39）：8031－8041.

［8］ Tripathi V，Ellis JD，Shen Z，et al.The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing bymodulating SR splicing factor phosphorylation［J］.Mol Cell，2010，39（6）：925－938.

［9］ Schmidt LH，Spieker T，Koschmieder S，et al.The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and inducesmigration and tumor growth［J］.J Thorac Oncol，2011，6（12）：1984－1992.

［10］ Guo F，Li Y，Liu Y，et al.Inhibition ofmetastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 in CaSki human cervical cancer cells suppresses cell proliferation and invasion［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2010，42（3）：224－229.

［11］ Jeffers LK，Duan K，Ellies LG，et al.Correlation of transcription of MALAT-1，a novel noncoding RNA，with deregulated expression of tumor suppressor p53 in small DNA tumor virus models［J］.J Cancer Ther，2013，4（3）.

［12］ Ren S，Liu Y，Xu W，et al.Long noncoding RNA MALAT-1 is a new potential therapeutic target for castration resistant prostate cancer［J］.J Urol，2013，190（6）：2278－2287.

［13］ Karin M.Nuclear factor-κB in cancer development and progression［J］.Nature，2006，441（7092）：431－436.

［14］ Lei K，Nimnual A，ZongWX，et al.The Bax subfamily of Bcl2-related proteins is essential for apoptotic signal transduction by c-Jun NH（2）-terminal kinase［J］.Mol Cell Biol，2002，22（13）：4929－4942.

［15］ Ismail N，Pihie AH，Nallapan M.Xanthorrhizol induces apoptosis via the up-regulation of bax and p53 in HeLa cells［J］.Anticancer Res，2005，25（3B）：2221－2227.

［16］ Lee KW，Kim MS，Kang NJ，et al.H-Ras selectively up-regulates MMP-9 and COX-2 through activation of ERK1／2 and NF-κB：an implication for invasive phenotype in rat liver epithelial cells［J］.Int JCancer，2006，119（8）：1767－1775.

［17］ Lin C，Song L，Gong H，et al.Nkx2-8 downregulation promotes angiogenesis and activates NF-κB in esophageal cancer［J］.Cancer Res，2013，73（12）：3638－3648.

［18］ Gong H，Song L，Lin C，et al.Downregulation ofmiR-138 sustains NF-κB activation and promotes lipid raft formation in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2013，19（5）：1083－1093.

Expressions and correlations of lncRNA MALAT-1 and NF-κB in patients w ith esophageal squamous cell carcinoma

YIN Yue1，ZHANG Zhao-yue1，MOU Xiao1，WU Shi1，MAO Chao-ming2，CHEN De-yu2
（1.School of Clinical Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Institute of Oncology，the Affiliated Hospital of Jiangsu U-niversity，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To evaluate the expression and correlations ofmetastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1（MALAT-1），and NF-κB in the esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）tissue.M ethods：The expressions of MALAT-1 and NF-κB mRNA were detected by qRT-PCR in 60 ESCC tissues and adjacent non-tumorous tissues.The expression of NF-κB protein was detected by immunohistochemical staining（SPmethod），and the relationship between MALAT-1 and clinico-pathological feature of ESCC patientswas analyzed，and the correlation was explored.Results：The expression of MALAT-1 and NF-κB both were higher in ESCC tissues than that in adjacent non-tumorous tissues（Z＝－3.600，P＜0.001；Z＝－2.856，P＜0.05）.The positive rate of NF-κB protein in ESCC tissues was significantly higher than that in adjacent non-tumor tissues（χ2＝36.39，P＜0.001）.Meanwhile，the higher expression of MALAT-1 and NF-κB were correlated with the differentiation degree，lymphnode metastasis and clinical stage of ESCC（P＜0.05）.And the expression of MALAT-1 and NF-κB was positive correlated（r＝0.795，P＜0.001）.Conclusion：MALAT-1 might play a significant role in the occurrence and development of ESCC.

metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1；NF-κB；esophageal squamous cell carcinoma；clinicopathological features

尹越（1988—），女，碩士研究生；陳德玉（通訊作者），教授，主任醫師，E-mail：cdeyu＠hotmail.com

R735.1

A

1671－7783（2014）02－0129－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y130264

鎮江市社會發展支撐計劃項目（SH2011019，SH2012023）

2013－11－27 ［編輯］ 何承志