額爾敦—烏日勒對兔動脈粥樣化易損斑塊模型血清超敏C反應蛋白及相關炎癥因子的影響

烏蘭其其格 麻春杰 呼日樂巴根 海英 布和朝魯 白龍 邸彥清

額爾敦—烏日勒對兔動脈粥樣化易損斑塊模型血清超敏C反應蛋白及相關炎癥因子的影響

烏蘭其其格 麻春杰 呼日樂巴根 海英 布和朝魯 白龍 邸彥清

目的觀察額爾敦—烏日勒對兔動脈粥樣硬化易損斑塊模型血清超敏C反應蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein -1，MCP-1)、細胞間粘附因子(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)、血管粘附因子(vascular adhesion molecule-1，VCAM-1)的影響，以探討額爾敦—烏日勒改善動脈粥樣硬化易損斑塊病變的可能機制。方法50只雄性新西蘭大耳白兔隨機分為4組，分別為正常組、模型組、額爾敦—烏日勒組及辛伐他汀組。通過高脂飼料、免疫損傷結合經股動脈球囊拉傷建立家兔動脈粥樣硬化易損斑塊模型，實驗第8周開始給藥至24周，取血檢測炎癥因子hs-CRP、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1；取主動脈，光鏡觀察組織結構。結果額爾敦—烏日勒組主動脈病變程度相對較輕，纖維帽厚度與內中膜厚度比值高于模型組(P<0.01)，同時能明顯降低動脈粥樣硬化家兔血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1含量(P<0.01)。結論額爾敦—烏日勒可能通過抑制炎癥反應，降低hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1上升水平來發揮抗動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的形成、發展和穩定易損斑塊的作用。

額爾敦—烏日勒； 動脈粥樣硬化； 高敏C反應蛋白； 炎性因子； 兔

目前大量的研究證據表明動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種慢性血管炎癥疾病[1-3]。炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化斑塊形成、發展和破裂的全過程。炎性細胞因子介導的炎癥反應在動脈粥樣硬化的發生發展中起了極其重要的作用。前期研究表明傳統蒙藥額爾敦—烏日勒具有消退早期動脈粥樣硬化的作用[4]。本研究主要觀察額爾敦—烏日勒對家兔動脈粥樣硬化易損斑塊病理、血清炎癥因子高敏C反應蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、細胞間粘附因子(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)、血管粘附因子(vascular adhesion molecule-1，VCAM-1)的影響，并探討額爾敦—烏日勒改善動脈粥樣硬化易損斑塊病變的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只健康雄性新西蘭大耳白兔，體重(2.0±0.2)kg，由北京市海淀區興隆實驗動物養殖廠提供，許可證編號：SCXK(京)2011-0006，分籠飼養，自由飲水。實驗在內蒙古醫科大學蒙醫藥研究院動物中心完成。

1.2 實驗用藥

額爾敦—烏日勒，批號：121164，2 g /10粒，30粒/瓶，內蒙古蒙藥股份有限公司生產。辛伐他汀片，批號：121002，20 mg/片，12片/盒，山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司生產。戊巴比妥鈉，批號：F20030816，中國醫藥集團上海試劑公司。牛血清白蛋白(Albumin, bovine, fraction V)CAS Number：9048-46-8，內蒙古呼和浩特市澤生試劑公司。肝素鈉注射液，批號：20110313，1.25萬U/2 ml，天津生物化學制藥有限公司生產。青霉素鈉，批號：Y1207622，160萬U/瓶，華北制藥股份有限公司生產。

1.3 主要試劑與儀器

hs-CRP試劑盒，貨號：CSB-E06847Rb，MCP-1試劑盒，貨號：CSB-E06921Rb，ICAM-1試劑盒，貨號：CSB-E06974Rb，VCAM-1試劑盒，貨號：CSB-E10092Rb，武漢華美生物工程有限公司；ST16R高速離心機，美國熱電公司 ；MULTISKAN MK3酶標儀，美國熱電公司；日本OLYMPUS-BX51生物顯微鏡(奧林巴斯)；HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統；DH4000A電熱恒溫培養箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及模型制備 50只新西蘭大耳白兔適應性飼養1周后，隨機分為正常對照組10只及造模組40只。正常對照組，每只喂飼普通飼料150 g/天，造模組喂飼由86%普通飼料+1%膽固醇+8%蛋黃粉+5%豬油配置的高脂飼料100 g/只/日(早)，普通飼料50 g/只/日(晚)直至24周取材。第2周造模組經兔耳緣靜脈一次性注射牛血清白蛋白500 mg/只，第4周用球囊拉傷術損傷動脈[5]。所有實驗兔均單籠飼養，自由飲水。第8周末，將所有實驗兔禁食12小時以上，經耳緣靜脈抽取空腹血檢測血清總膽固醇(total cholestrol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)及低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平，結果顯示造模組血脂水平均顯著升高，隨機選取4只造模組兔處死后，剝離主動脈全長，剖開血管壁均可見明顯隆起斑塊，表明兔AS模型建立成功。將造模組兔子隨機分為模型組、辛伐他汀組(簡稱辛伐組)、額爾敦—烏日勒組(簡稱額爾敦組)。

1.4.2 給藥方法 將辛伐他汀片和額爾敦—烏日勒研磨、分別用蒸餾水制備混懸液，用灌服給藥。參照動物與人體體重等效劑量折算系數，依據每只實驗兔的體重，計算出相應的給藥劑量。每天1次，連續給藥16周。每2周稱量體重一次，據此調整給藥劑量。其中辛伐他汀為陽性對照藥，模型組用等容積的蒸餾水灌胃。

1.4.3 主動脈病理形態學檢查 第24周實驗結束取血后處死動物，取主動脈弓段約1 cm放入10%中性甲醛溶液中固定、梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋，切片，切片厚度5 μm作HE染色，光鏡下觀察受損血管組織形態學改變，同時采用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統測量主動脈壁纖維帽厚度(fiber cap thickness，FCT)、內中膜厚度(intima-media thickness，IMT)，并計算纖維帽厚度與內中膜厚度比值(FCT/IMT)。

1.4.4 血清指標檢測 第24周，用50 ml注射器體外心臟采血，放入50 ml的離心管中，靜止1小時后，4000 r/min離心15分鐘后取血清，-20℃冰箱保存，待測試。hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1測定均采用酶聯免疫吸附(雙抗體夾心)法，根據試劑盒提供的試劑與實驗步驟要求進行操作，用MULTISKAN MK3酶標儀完成測定。

1.5 統計學處理方法

2 結果

2.1 主動脈病理形態學觀察

正常對照組家兔主動脈血管內膜比較光滑，無粥樣病損，無脂質斑塊形成。光鏡下內皮細胞完整，內彈力膜清晰，未見斷裂，內膜無增厚，中膜平滑肌細胞排列有序，外膜纖維結締組織未見異常。模型組家兔主動脈內膜粗糙不平，肉眼可見淺黃色條紋或大小不等斑塊隆起，光鏡下可見血管內膜增厚明顯，內皮細胞脫落，粥樣斑塊形成，內皮下見脂質浸潤，脂質核心大，脂質核心內大量泡沫細胞及炎性細胞浸潤，中膜平滑肌細胞增殖，向內膜遷移，斑塊內可見新生的小血管。相比之下，給藥組(額爾敦—烏日勒組和辛伐他汀組)家兔主動脈病變程度相對較輕，光鏡下可見主動脈內皮有不同程度損傷，脫落，內皮細胞下有少量泡沫細胞聚集,平滑肌排列比較規則。同時實驗結果顯示，額爾敦—烏日勒組FCT、FCT/IMT比值均高于模型組(P<0.01)，與辛伐他汀組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 額爾敦—烏日勒對AS家兔主動脈病理形態的影響

注：與模型組比較，aP<0.01；與辛伐他汀組比較，bP<0.05

2.2 血清炎性因子的影響

實驗結果顯示，模型組家兔血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1水平較正常明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，額爾敦—烏日勒能明顯降低動脈粥樣硬化家兔hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1水平，差異具有統計學意義(P<0.01)；與辛伐他汀組比較，在降低模型組家兔的hs-CRP和MCP-1方面亦具有一定優勢(P<0.05)，見表2。

表2 額爾敦—烏日勒對AS家兔血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1含量的影響

注：與正常組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01;與辛伐他汀組比較,cP<0.05

3 討論

已經有許多研究表明，血清炎性因子hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1等可作為反映AS斑塊穩定程度的炎癥標志物，是心血管疾病危險預測的重要指標。hs-CRP多方面參與了動脈粥樣硬化機制，如能夠調節巨噬細胞攝入低密度脂蛋白，有助于泡沫細胞的形成；激活粥樣斑塊內的補體系統導致斑塊不穩定，增強不穩定性斑塊的血管活性等。hs-CRP可以直接誘導動脈粥樣硬化的發展，因此CRP是心血管疾病的獨立危險因素[6]。hs-CRP誘導內皮產生單核細胞趨化蛋白(MCP-1)，上調ICAM-1、VCAM-1，介導巨噬細胞攝入天然LDL，使單核細胞組織因子增加，引起動脈內膜損傷，最終導致斑塊和血栓形成[7]。大量實驗病理學和分子生物學的研究資料證明，ICAM-1和VCAM-1可介導白細胞與內皮細胞的滾動和穩定黏附，并繼而在單核細胞趨化蛋白(MCP-1)等炎癥因子的協助下穿越血管表層，啟動局部的炎癥反應，因而在動脈粥樣硬化發展中起著關鍵性的作用。MCP-1作為趨化因子家族中的一員，在AS病變早期，主要是趨化單核細胞向血管內膜遷移，活化為巨噬細胞，在AS晚期，則對血管平滑肌細胞的增生和向血管內膜的遷移具有趨化增殖的作用，同時通過誘導組織因子的表達，促進血栓形成[8]。

近年來蒙醫藥對冠心病的研究，不論在病因病機、臨床癥狀治療及蒙醫分型研究方面均取得了一定的成果。傳統蒙藥額爾敦—烏日勒是蒙醫治療“白脈病”(類似于腦出血、腦血栓、神經損傷、神經根炎等腦神經系統疾病)、“協日烏素”(風濕、類風濕等病)、“薩病”(中風或腦卒中)的常用蒙成藥，由珍珠、石膏、丁香、紅花、土木香、木香、檀香、地錦草、沉香、麝香、牛黃、水牛角、炯麻子、白苣勝等29味純天然藥材組成。近些年對額爾敦—烏日勒的研究逐步深入，臨床研究表明其治療腦梗塞、腦血栓、冠心病、心絞痛等心腦血管疾病療效顯著[9-11]。

本研究結果顯示，傳統蒙藥額爾敦—烏日勒能明顯降低動脈粥樣硬化家兔血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1含量，差異具有統計學意義(P<0.01)；與辛伐他汀組比較，在降低模型組家兔的hs-CRP和MCP-1面亦具有一定優勢(P<0.05)。從病理形態學檢查看，能增加斑塊表面纖維帽厚度、改善纖維帽與內中膜厚度比值。總之以上結果表明額爾敦—烏日勒可能通過抑制炎癥反應，降低hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1上升水平來發揮抗AS的形成、發展和穩定易損斑塊的作用。

[1]Saito M, Ishimitsu T, Minami J, et al. Relations of plasma high sensitivity C-reactive protein to traditional cardiovascular risk factors[J]. Atherosclerosis, 2003, 167(1):73-79.

[2]Sesso HD, Buring JE, Rifai N, et al. C-reactive protein and the risk of developing hypertension [J]. JAMA,2003, 290(22):2945-2951.

[3]Magyar MT, Szik szai Z, Balla J, et al. Early-on set carotid at hero-sclerosis is ass ociated with increased intima-media thickness and elevated serum levels of inflammatory markers[J].Stroke, 2003, 34(11):58-63.

[4]麻春杰，董平，韓雪梅，等.額爾敦—烏日勒在家兔動脈粥硬化斑塊消退中的作用及其對炎癥因子的影響[J].世界科學技術—中醫藥現代，2011,13(5)：894-897.

[5]張軍平，彭立，李良軍，等.實驗性兔主動脈粥樣硬化易損斑塊模型的建立與評價[J].中國實驗動物學報，2009,17(3)：161-165.

[6]胡大軍，劉劍萍，廖昆，等.低分子肝素對兔動脈粥樣硬化易損斑塊模型血清CRP、IL-6的影響[J].中國老年學雜志，2013,33(18)：4468-4469.

[7]謝心，吳堅，竺春玲，等.益氣養陰方對動脈粥硬化大鼠免疫炎癥因子hs-CRP、sVCAM-1、sICAM-1影響的實驗研究[J].江蘇中醫藥，2013，45(3)：73-74.

[8]張娜，李林森.炎癥與動脈粥硬化關系的新認識及有關中藥的研究進展[J].藥物評價研究，2013,36(4)：302-303.

[9]詠梅.蒙醫心刺痛·血性心刺痛的診療方案[J].中國民族醫藥雜志，2010，16(7)：32-33.

[10]瑞圖雅，金花，包淑芝.蒙醫辨證論治勞力型心絞痛68例臨床報告[J].中國民族醫藥雜志，2005,5(4)：4-5.

[11]嘎·畢雅圖，烏云高娃，薩日娜.珍寶丸為主治療高血壓所致腦出血11例[J].內蒙古民族大學學報(蒙醫藥學·蒙古文版)，2002,12(1)：75-76.

(本文編輯：蒲曉田)

Influencesofserumhs-CRPandrelevantinflammatoryfactorsonrabbitatheroscleroticvulnerableplaquemodelwithEerdun-wurili

Wulanqiqige,MAChun-jie,Hurilebagen,etal.

CollegeofBasicMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

MAChun-jie,E-mail:13514819729@163.com

ObjectiveTo observe the influences of serum high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), intercellular adhesion molecule (ICAM-1), and vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1) on rabbit model of atherosclerotic vulnerable plaque with Eerdun-wurili and explore its possible mechanism.MethodsFifty New Zealand rabbits were randomly divided into 4 groups: the normal control group, the model group, the Eerdun-wurili group and the smivastatin group.The model was established by high fatty diet feeding,combined with immune injury and femoral arterial balloon tearing. From the 8th week the medication was given and the levels of serum hs-CRP，MCP-1，ICAM-1 and VCAM-1 were measured at the 24th week of experiment. Tissue structure of aortic were observed under light microscope.ResultsAortic lesions is relatively milder in the Eerdun-wurili group and the fibrous cap thickness and lntima media thickness ratios in the Eerdun-wurili group were higher than those of model group; besides, the levels of serum hs-CRP,、ICAM-1,、VCAM-1、and MCP-1 were decreased significantly (P<0.01).ConclusionEerdun-wurili could prevent AS formation and stabilize atherosclerosis vulnerable plaque. It acts by suppressing the inflammation reaction.

Eerdun-wurili; Atherosclerosis; High-sensitivity C-reactive protein; Inflammatory factors; Rabbits

國家自然科學基金(81160464)

100029 北京中醫藥大學基礎醫學院[烏蘭其其格(博士研究生)]；內蒙古醫科大學蒙醫藥學院(烏蘭其其格、呼日樂巴根、海英、布和朝魯、白龍)，中醫學院(麻春杰、邸彥清)

烏蘭其其格(1979- ),女，2011級在讀博士研究生，實驗師。研究方向：蒙藥藥理研究。E-mail:mywulan2008@163.com

麻春杰(1956- )，女，教授，博士生導師，主任醫師。研究方向：中(蒙)醫藥防治心腦血管疾病的研究。E-mail:13514819729@163.com

R29

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.03.005

2013-12-19)