基于普魯士藍(lán)/碳納米管納米棒修飾電極用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)的研究

鄧 祥, 黃小梅, 吳 狄

(四川文理學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系,四川達(dá)州635000)

近年來(lái),隨著國(guó)內(nèi)農(nóng)林業(yè)病蟲害的不斷發(fā)生,造成農(nóng)林業(yè)大量使用農(nóng)藥.因有機(jī)磷農(nóng)藥(OPs)具有較高的藥效,對(duì)植物的藥害小,在人、畜體內(nèi)一般不積累等特點(diǎn)[l],是目前國(guó)內(nèi)用途最為廣泛的一類農(nóng)藥,主要用于防治果蔬病、蟲、害.但是,隨著有機(jī)磷農(nóng)藥的大量使用,部分農(nóng)藥殘留在環(huán)境中來(lái)不及分解,從而造成對(duì)土壤、水體的嚴(yán)重污染.對(duì)人類健康產(chǎn)生潛在的威脅.殘留在環(huán)境中的農(nóng)藥隨著食物鏈進(jìn)入人體體內(nèi),其磷?；c體內(nèi)膽堿脂酶的活性部分進(jìn)行結(jié)合,形成磷?；憠A酶從而使其分解乙酰膽堿的能力喪失,導(dǎo)致人體內(nèi)乙酰膽堿大量積累,并抑制體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性,致使神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì):乙酞膽堿的新陳代謝紊亂,引起中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)功能異常,導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)失調(diào)、昏迷、癱瘓甚至導(dǎo)致死亡等癥狀.所以,及時(shí)、準(zhǔn)確地對(duì)OPs殘留進(jìn)行監(jiān)控與檢測(cè)是十分必要的.

有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的常用檢測(cè)方法主要有:高效液相色譜(HPLC)法[2]、高效液相色譜(HPLC)-質(zhì)譜(MS)法[3]和氣相色譜(GC)法[4]等.上述方法雖然能對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留情況進(jìn)行比較準(zhǔn)確地檢測(cè),但也存在樣品處理過(guò)程復(fù)雜,檢測(cè)周期長(zhǎng)和儀器設(shè)備價(jià)格昂貴等缺陷,不能滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求.隨著生物傳感技術(shù)的迅猛發(fā)展,越來(lái)越多的科研技術(shù)工作者著力研發(fā)靈敏度高、方便、快捷、主要用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和檢測(cè)的有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器[5-6].為了排除某些電活性物質(zhì)的干擾,降低工作電位.各種各樣的電子媒介體被用于生物傳感器中,以期達(dá)到提高電極和生物酶之間的電子傳導(dǎo)性能,促進(jìn)電子的傳遞速率.但是,由于大多數(shù)電子媒介體的相對(duì)分子質(zhì)量較小,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,分子量較小的電子媒介體極其容易滲漏而進(jìn)入測(cè)試底液中對(duì)電極造成污染,從而對(duì)電極的響應(yīng)性能產(chǎn)生影響.為了消除這一影響,部分研究表明將電子媒介體與其他載體相連接以增大分子量降低其滲漏現(xiàn)象[7].碳納米管(MWCNTs)作為一種新型的納米材料,由于其獨(dú)特的管狀結(jié)構(gòu)和較強(qiáng)的導(dǎo)電性能,廣泛應(yīng)用于生物電分析和生物傳感器的研究[8-10].碳納米管能夠縮短其與氧化還原蛋白質(zhì)中氧化還原中心的距離[11-12],使電子轉(zhuǎn)移更容易進(jìn)行.本文選用MWCNTs為模板合成PB包埋MWCNTs的納米棒(PB@MWCNTs).然后將PB@MWCNTs用CS分散,固定到玻碳電極上,然后通過(guò)靜電吸附將乙酰膽堿酯酶(AChE)修飾于電極表面,制得的乙酰膽堿酯酶的酶抑制電流型傳感器應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)研究,效果較好.該酶抑制電流型傳感器主要利用PB@MWCNTs良好的導(dǎo)電性、吸附性和生物相容性,實(shí)現(xiàn)了對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè).由于納米材料間的協(xié)同作用,充分發(fā)揮了各種材料功效,使該傳感器具有檢測(cè)線性范圍寬、靈敏度高、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器碳納米管(MWCNTs,中科院成都有機(jī)化學(xué)有限公司);殼聚糖(CS)、乙酰膽堿(ATCh)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、呋喃丹均購(gòu)自Sigma公司;氯化鉀(KCl)、氯化鐵(FeCl3)、鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)等試劑均購(gòu)于成都科龍?jiān)噭┯邢薰?磷酸鹽緩沖溶液(PBS)通過(guò) KH2PO4-K2HPO4溶液配制而成.實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水,其他試劑均為分析純?cè)噭?TECNAI10型透射電鏡(TEM,荷蘭PHILIPSFEI公司);CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);FA1004N電子天平(上海菁海儀器公司);,KQ-300VDB型超聲波清洗器超聲清洗機(jī)(上海譜振生物科技有限公司);pHS-4C型酸度計(jì)(成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司).

1.2 PB@MWCNTs納米棒的制備[13]將5 mg經(jīng)酸處理過(guò)的MWCNTs均勻地分散于1 mL二次蒸餾水中,然后將MWCNTs加入到5.0 mmol/L K3Fe(CN)6、5.0 mmol/L FeCl3和KCl混合溶液中并用3 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH約為1.5.攪拌反應(yīng)20 h后,將溶液離心分離并用二蒸餾水洗滌至中性,即得PB@MWCNTs納米棒.圖1為PB@MWCNTs納米棒的透射電鏡圖(TEM),由圖可見(jiàn)PB納米顆粒已均勻牢固地吸附于碳納米管外管壁.

圖1 PB@MWNTs納米棒的透射電鏡圖Fig.1 The TEM image of PB@MWNTs nanorodes

1.3 AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器的制備實(shí)驗(yàn)前,將玻碳電極(GCE)表面用0.5 μm的Al2O3粉末進(jìn)行拋光處理,并依次用二次蒸餾水、HNO3(1.0 mol/L)、NaOH(1.0 mol/L)、丙酮以及二次蒸餾水各超聲清洗電極5 min.10 mg CS粉末溶解于5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的HAc溶液中,制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的CS溶液,加入5 mg PB@MWCNTs納米棒,攪拌均勻,即制得1 mg/mL CS-PB@MWCNTs懸濁液.取10 μL CS-PB@MWCNTs懸濁液滴涂于玻碳電極表面,室溫晾干.將CS-PB@MWCNTs/GCE電極置于0.3單位/mL AChE溶液中浸泡1 h后取出,用二次蒸餾水沿電極側(cè)壁沖洗,氮?dú)獯蹈蓚溆?

1.4 AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)在5.0 mL PBS溶液中加入一定量的ATCh,使其濃度為1.0 mmol/L,攪拌5 min后,在溶液靜置狀態(tài)用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描,記錄下掃描過(guò)程中產(chǎn)生的峰電流;另取一份相同的ATCh溶液,同時(shí)加入一定量的已知濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥樣品,待抑制時(shí)間達(dá)到10 min后,檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的不同濃度情況下對(duì)峰電流的影響.利用公式計(jì)算即可得到有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)傳感器的抑制率.

1.5 實(shí)際樣品準(zhǔn)備與測(cè)試采摘新鮮的卷心菜、生菜和小白菜.將蔬菜剪碎,稱取其試樣10.00 g,置于50 mL燒杯中,加入10 mL水和20 mL丙酮,用超聲儀超聲15 min.然后將超聲萃取得到的懸濁液在離心機(jī)上離心分離后,取上層清液進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)由標(biāo)準(zhǔn)溶液作出的農(nóng)藥工作曲線,可以檢測(cè)出蔬菜上的農(nóng)藥含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器的電化學(xué)行為實(shí)驗(yàn)研究了傳感器在pH 7.1的PBS中不同掃速下的循環(huán)伏安圖.其結(jié)果見(jiàn)圖2所示,掃描速度從20 mV/s到300 mV/s,氧化還原峰電流隨著掃描速度的增大而增大,并且由圖中可知峰電流與掃描速度的平方根成線性關(guān)系,由此可見(jiàn)該電極反應(yīng)受表面擴(kuò)散的控制.

2.2 AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器檢測(cè)機(jī)理有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)AChE的催化活性具有抑制作用,導(dǎo)致AChE對(duì)底物催化產(chǎn)生的ATCh濃度下降,電流減小[14].同時(shí)隨著有機(jī)磷農(nóng)藥質(zhì)量濃度的不斷增大,有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)酶電極的抑制率也不斷增大.所以,通過(guò)比較AChE水解產(chǎn)生ATCh的氧化電流大小,可以計(jì)算得到有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)ATCh的抑制率,同時(shí)可以用來(lái)計(jì)算有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度.ATCh的抑制率可由[15-16]

計(jì)算得出,式中,A指酶抑制率(與農(nóng)藥殘留具有正相關(guān)性),I0為ATCh傳感器對(duì)一定質(zhì)量濃度的ATCh產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)電流(空白電流),I指被毒劑抑制酶電極穩(wěn)態(tài)響應(yīng)電流.

圖2 傳感器在pH 7.1的PBS中不同掃速的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of the AChE/CS-PB@MWNTs/GCE modified electrode in pH 7.1 PBS solution at different scan rates

圖3 電位對(duì)電流響應(yīng)的影響Fig.3 Effect of potential on the amperometric response of the sensor to 1.0 mmol/L ATCh

2.3 測(cè)定條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值的影響 在實(shí)驗(yàn)中還考察了磷酸緩沖液的pH值對(duì)酶?jìng)鞲衅鞔呋疉TCh電流響應(yīng)的影響.在 pH值7.0～8.0之間,AChE催化活性較高[17],但pH值的增大,會(huì)導(dǎo)致有機(jī)磷發(fā)生水解,故選擇pH值7.1的PBS緩沖液作為測(cè)試底液.

2.3.2 工作電位優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)考察了不同工作電位對(duì)酶?jìng)鞲衅麟娏黜憫?yīng)的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.隨著工作電位的逐漸增大,電流響應(yīng)也不斷增強(qiáng),當(dāng)工作電位達(dá)到0.5 V后電流的增大情況趨于穩(wěn)定.由于電位過(guò)高會(huì)影響傳感器的抗干擾能力,同時(shí)傳感器使用壽命也會(huì)降低[18],所以實(shí)驗(yàn)中選擇0.5 V為工作電位.

2.3.3 底物濃度的影響 底物濃度會(huì)影響檢測(cè)的穩(wěn)定時(shí)間,底物濃度太小,無(wú)法確保每次測(cè)量的順利完成;底物濃度太大,又會(huì)造成殘留,對(duì)第二次的檢測(cè)帶來(lái)影響.對(duì)底物濃度進(jìn)行了優(yōu)化選取,如圖4可見(jiàn),0.50 mmol/L和2.0 mmol/L的底物無(wú)法達(dá)到穩(wěn)態(tài)的電流,以1.0 mmol/L比較適宜.

圖4 不同濃度的硫代乙酰膽堿(底物)對(duì)應(yīng)的電流-時(shí)間關(guān)系曲線Fig.4 Acetylthiocholine different concentrations(substrate)corresponds to the I-t curve

2.4 AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器對(duì)硫代乙酰膽堿的線性范圍及其酶動(dòng)力學(xué)研究在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,圖5為AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器對(duì)不同濃度硫代乙酰膽堿的電流響應(yīng)及工作曲線.圖5中顯示了在PBS中,連續(xù)加入不同濃度的硫代乙酰膽堿,響應(yīng)電流和硫代乙酰膽堿濃度的關(guān)系.由此可知,該傳感器對(duì)硫代乙酰膽堿檢測(cè)的線性范圍為 1.68×10-5～4.25×10-3mol/L,相關(guān)系數(shù)為0.999 2.

根據(jù)圖5中傳感器對(duì)硫代乙酰膽堿線性響應(yīng),利用Lineweaver-Burk公式[19]

得到乙酰膽堿酯酶的表觀米氏常數(shù)Km為0.52 mmol/L.較低的米氏常數(shù),說(shuō)明通過(guò)鏈接反應(yīng)固定的乙酰膽堿酯酶保持了良好的酶動(dòng)力學(xué)響應(yīng),并且符合米氏動(dòng)力學(xué)方程.

圖5 連續(xù)改變不同濃度的硫代乙酰膽堿后的I-t響應(yīng)及工作曲線Fig.5 Amperometric response of AchE/CS-PB@MWNTs/GCE on the addition of different concentrations of ATCh at 0.5 V in 1.0 mmol/L PBS(7.1)

2.5 農(nóng)藥的測(cè)定首先考察孵育時(shí)間對(duì)OPs抑制AChE效果的影響,由圖6可見(jiàn),從0～10 min內(nèi)OPs對(duì)酶的抑制率增加迅速,隨后抑制率的變化趨于穩(wěn)定.即使對(duì)于極低濃度的呋喃丹,10 min的孵育時(shí)間足以使農(nóng)藥對(duì)酶產(chǎn)生10%的抑制率.為了提高此方法對(duì)OPs農(nóng)藥的檢測(cè)效率,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的孵育時(shí)間以10 min作為標(biāo)準(zhǔn).檢測(cè)了不同濃度下有機(jī)磷農(nóng)藥呋喃丹對(duì)AChE活性的抑制率.由圖7可見(jiàn),該酶?jìng)鞲衅鲗?duì)有機(jī)磷農(nóng)藥吠喃丹的檢測(cè)范圍為6～80 nmol/L,由于有文獻(xiàn)報(bào)道10%的抑制率(I%)所對(duì)應(yīng)的抑制劑濃度可以定義為理論檢測(cè)限[20],因此該傳感器對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥呋喃丹的檢測(cè)限為3 nmol/L.

圖6 不同抑制時(shí)間對(duì)傳感器電流響應(yīng)的影響Fig.6 The effect of the inhibition time on the response of the sensor

2.6 傳感器的穩(wěn)定性將制備好的酶?jìng)鞲衅鲬矣赑BS緩沖溶液上方,置于4℃冰箱中保存,一周內(nèi)傳感器對(duì)ATch的響應(yīng)無(wú)明顯變化,15 d后,響應(yīng)電流下降了7.8%,30 d后,響應(yīng)電流仍保持為86.5%,此結(jié)果表明,該酶?jìng)鞲衅鞯姆€(wěn)定性能良好,使用壽命較長(zhǎng).

3 結(jié)論

本文以殼聚糖(CS)為交聯(lián)劑,研究制備了PB@MWCNTs納米棒修飾的乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅?通過(guò)酶抑制法對(duì)OPs殘留進(jìn)行了檢測(cè),對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥呋喃丹的檢測(cè)限為3 nmol/L.制備的PB@MWCNTs納米棒具有大的比表面積、好的導(dǎo)電性和優(yōu)良的生物兼容性,使該傳感器具有檢測(cè)限低、穩(wěn)定性好、靈敏度高及使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),并對(duì)其它OPs也有較好的響應(yīng).因此,本方法在快速檢測(cè)OPs殘留的應(yīng)用中有著廣闊的前景.

圖7 不同濃度呋喃丹對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制率Fig.7 The inhibition rate of the acetylcholinesterase on the sensor with different concentrations of carbofuran

致謝四川文理學(xué)院特色植物開(kāi)發(fā)研究四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(SCTZ201305)對(duì)本文給予了資助,謹(jǐn)致謝意.

[1]Okazaki S,Nakagawa H,Fukuda K,et al.Re-activation of an amperometric organophosphate pesticide biosensor by 2-pyridinealdoxime methochloride[J].Sens Actuat,2000,B66:131-134.

[2]Lacorte S,Barcelo D.Validation of an automated precolumn exchange system(PROSPEKT)coupled to liquid chromatography with diode array detection.Application to the determination of pesticides in natural waters[J].Analytica Chimica Acta,1994,296:223-234.

[3]葉瑞洪,蘇建峰.分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定果蔬、牛奶、植物油和動(dòng)物肌肉中殘留的61種有機(jī)磷農(nóng)藥[J].色譜,2011,7:618-623.

[4]劉詠梅,王志華,儲(chǔ)曉剛.凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜分離同時(shí)測(cè)定糙米中50種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留[J].分析化學(xué),2005,6:808-810.

[5]曲云鶴,肖飛,程欲曉,等.Tyr/Glu/Fe3O4/Nafion/CNT/GCE酪氨酸酶生物傳感器的制備及應(yīng)用于農(nóng)藥檢測(cè)的研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào),2010,68:535-539.

[6]Georgiou,Claude M,Nicole J R.Early-warning electrochemical biosensor system for environmental monitoring based on enzyme inhibition[J].Sens Actuat,2005,B60:81-87.

[7]Garccia Armada M P,Losada J,CuadradoI,et al.Electrodes modified with a siloxane copolymer containing interacting ferrocenes for determination of hydrogen peroxide and glucose[J].Sensors Actuators,2003,B88:190-197.

[8]Liu Q,Lu X B,Li J,et al.Direct electrochemistry of glucose oxidase and electrochemical biosensing of glucose on quantum dots/carbon nanotubes electrodes[J].Biosens Bioelectron,2007,22:3203-3209.

[9]Chen X L,Chen J H,Deng C Y,et al.Amperometric glucose biosensor based on boron-doped carbon nanotubes modified electrode[J].Talanta,2008,76:763-767.

[10]Zhang Y,Yuan R,Chai Y Q,et al.Simultaneous voltammetric determination for DA,AA and NO2-based on graphene/polycyclodextrin/MWCNTs nanocomposite platform[J].Biosens Bioelectron,2011,26:3977-3980.

[11]Gooding J J,Wibowo R,Liu J Q,et al.Protein electrochemistry using aligned carbon nanotube arrays[J].J Am Chem Soc,2003,125:9006-9007.

[12]Liu J Q,Chou A,Rahmat W,et al.Achieving direct electrical connection to glucose oxidase using aligned single walled carbon nanotube arrays[J].Electroanal,2005,17:38-46.

[13]Zhai J F,ZhaiY M,Wen D,et al.Prussianblue/multiwalled carbon nanotube hybrids:synthesis,assembly and electrochemical behavior[J].Electroanal,2009,21:2207-2212.

[14]閔紅,曲云鶴,李曉華,等.Au摻雜Fe3O4納米粒子酶?jìng)鞲衅鞯闹苽浼捌鋺?yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)的研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào),2007,65(20):2303-2308.

[15]Qu Y H,Sun Q,Xiao F,et al.Layer-by-Layer self-assembled aeetyleholinesterase/PAMAM-Au on CNTs modified electrode for sensing pesticides[J].Bioeleetrochemisty,2010,77:139-143

[16]孫春燕,李宏坤,平紅,等.AuNPs/Sol-gel復(fù)合膜法固定乙酰膽堿酯酶生物傳感器檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2011,11(32):2533-2538.

[17]Vangelis G A,Yannis D C.Novel fiber-optic biosensor based on immobilized glutathione S-transferase and sol-gel entrapped bromcresol green for the determination of atrazine[J].Anal Chim Acta 2002,460:151-161.

[18]Joshi K A,Tang J,Haddon R,et al.A disposaple biosensor for organophosphorus nerve agents based on car-bon nanotubes modified thick film strip electrode[J].Electroanalysis,2005,17(1):54-58.

[19]Kamin R A,Wilson G S.Rotating ring-disk enzyme electrode for biocatalysis kinetic studies and characterization of the immobilized enzyme layer[J].Anal Chem,1980,52:1198-1205.

[20]Lee H S,KimY,ChoY A.Oxidation of organophosphorus pesticides for the sensitive detection by a cholinesterase-based biosensor[J].Chemosphere,2002,46:571-576.