R-苯乙醇高產菌株的篩選及分子生物學鑒定

王 丹, 曾順澤, 彭 果, 姜青貴, 何 浪

(成都醫學院生物醫學系,四川成都610083)

手性苯乙醇及其衍生物是合成多種手性藥物如R-地諾帕明、R-托莫西汀、S-氟西汀、R-沙丁胺醇等的重要中間體[1].為獲得光學活性純的苯乙醇,應用最廣的是化學催化不對稱合成法[2-4].近年來,生物催化因反應條件溫和、產物立體選擇性高、對環境友好等優點成為獲得光學活性產物的另一種有效途徑[5-8].目前,生物法不對稱還原前手性芳香酮的相關報道較多[9-11],但仍然無法實現工業化生產的原因之一就是生產菌株催化活性不穩定、產物積累量不高及立體選擇性較差.并且,篩選到的菌株催化產物大多為S-構型[12-14],R-構型較少.為獲得光學活性苯乙醇的高產菌株,我們將薄層色譜TLC分析法應用到苯乙醇產生菌株的篩選工作中,成功篩選到一株可將苯乙酮不對稱還原合成R-苯乙醇的菌株cmq6-8,根據該菌株的26SrDNADl/D2區域分析的結果,并結合菌株cmq6-8的部分生理生化特征,初步鑒定cmq6-8為解脂耶氏酵母菌,為下一步的發酵條件和轉化條件的優化,以及生物催化不對稱合成R-苯乙醇及其衍生物的工業化生產提供理論及技術支持.

1 材料與方法

1.1 樣品成都某手性化工廠污水處理池附近采集的土壤樣品及本實驗室保存菌株.

1.2 菌株的分離與純化首先將采集的土壤樣品配制成懸液,適當稀釋后涂布于篩選培養基,30℃,培養3～5 d后挑取形態各異的單菌落轉接于PDA斜面上,30℃,培養3～5 d后于4℃保存,備用.

1.3 菌體培養用無菌牙簽從PDA斜面上挑取少量菌苔接種于20 mL種子培養基中,30℃,170 r/min,搖床(上海智城分析儀器制造有限公司,ZHWY-211C型)培養24 h后再按5%的接種量接入50 mL發酵培養基中,30℃,170 r/min,搖床培養48 h,備用.

1.4 生物轉化收集發酵液,于6 000 r/min、4℃、離心10 min.將菌體沉淀用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液洗1～2次后,將5 g濕菌體轉接入20 mL pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液中,按體積分數2%和終濃度108 mmol/L加入葡萄糖和底物苯乙酮,30℃、170 r/min轉化48 h.轉化結束后,按體積比1∶1的量向轉化體系中加入乙酸乙酯,充分震蕩后,靜止2～3 min,于6 000 r/min,4℃,離心10 min,取上清液進行TLC檢測.

1.5 TLC分析(初篩)將鋪好的硅膠薄層板放在烘箱中,按照50℃、30 min;80℃、30 min;110℃、1 h的步驟進行活化.活化后放于干燥器中冷卻,備用.在距離薄層板底部邊沿約3 cm處,用鉛筆輕輕劃一條直線為點樣線,并用鉛筆標識點樣點,點樣量為0.2 mL.展開劑為甲苯和乙酸乙酯的混合液(體積比V甲苯∶V乙酸乙酯=4∶1),展開時間為8 min,之后用254 nm UV照射及碘蒸氣熏蝕2種方法顯現底物苯乙酮及產物苯乙醇所產生的斑點.最后根據斑點的大小和顯色的深淺對菌種的轉化能力進行初步判斷.

1.6 GC分析(復篩)選取出現產物苯乙醇斑點且斑點較大、顏色較深的菌株進入復篩.菌體培養及生物轉化過程同上.轉化還原反應結束后,反應液用乙酸乙酯萃取(1∶1,體積比),再用無水Mg-SO4干燥后進行GC分析.使用GC-960氣相色譜儀,HP Chiral 10%3-Cyclodextrin手性色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);檢測條件:載氣為氮氣,進樣器、色譜柱和FID檢測器溫度分別為220、110和200℃;分流比為1∶100;進樣量為0.1 mL.分別以底物的轉化率和產物的對映體過量值表示反應的轉化程度和立體選擇性,其表達式為

其中,c0為底物的初始濃度,c苯乙醇為反應終止時的產物濃度,cR和cS分別為R-型和S-型產物的濃度.

1.7 催化活性穩定性實驗將菌株連續傳代20次,在0～4℃的冰箱中保存.再從每一代的斜面培養基上刮1滿環菌苔于種子培養基中培養及轉化,過程同上.再通過GC檢測其底物的轉化率及產物的對映體過量值.

1.8 菌落形態及生理特征分析利用肉眼及顯微鏡觀察固體平板上的菌落形態及細胞,并根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》[15]所列的酵母菌種鑒定方法進行生化特征分析.

1.9 分子生物學鑒定

1.9.1 酵母基因組DNA提取 參考《酵母基因組提取試劑盒》的操作說明,提取酵母基因組DNA.

1.9.2 26SrDNAD1/D2區域的PCR擴增26SrDNAD1/D2區域的PCR擴增采用通用引物對NL1(5′-GCAT CAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)PCR 反應體系(50 μL):10×PCR 緩沖液,5 μL;Mg2+(5 mmol/L),3 μL;dNTP(各 2.5 mmol/L),4 μL;引物(10 μmol/L)各 1 μL;TaqDNA 聚合酶 0.5 μL;模板DNA 2.0 μL;去離子水33.5 μL.擴增程序為:94 ℃、10 min,94℃、1 min,50℃、1 min,72 ℃、1 min;35個循環后72℃、10 min.取5 μL產物于1%的瓊脂糖凝膠(含GV染料)電泳,紫外燈下觀測結果.

1.9.3 序列分析和系統樹的構建 將擴增出的PCR產物40 μL,送華大基因公司(北京)完成測序工作.根據供試菌株的26SrDNA序列,運用Blast程序在GenBank數據庫中分別進行同源序列搜索.根據同源序列搜索的結果,下載相關菌種的26SrDNA序列,與供試菌株的序列一同用Clustal X 1.83軟件進行多序列比對,結果采用MEGA3.1中的鄰接法進行系統樹的構建,并用Bootstrap對進化樹進行1 000次可信度分析.

1.10 各種培養基篩選用培養基(底物誘導):苯乙酮1 g/L,蛋白胨 1 g/L,(NH4)2SO41 g/L,瓊脂粉17 g/L,蒸餾水1000 mL,pH自然;斜面培養基(PDA):馬鈴薯200 g/L,葡萄糖 20 g/L,瓊脂粉17 g/L,蒸餾水 1 000 mL,pH自然;種子培養基(YPD):葡萄糖 10 g/L,酵母膏 5 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7;發酵培養基:蛋白胨 10 g/L,酵母膏5 g/L,葡萄糖20 g/L,(NH4)2SO4g/L,KH2PO42 g/L,蒸餾水1 000 mL,pH 7.上述培養基的滅菌條件均為115℃、30 min.

1.11 主要試劑與藥品苯乙酮、R/S-苯乙醇、硅膠GF254均購自成都蜀都化學試劑公司,純度為99%;S-苯乙醇、R-苯乙醇標準品購自Sigma-Aldrich,手性選擇性≥99%(對映體總和,氣象色譜GC);其它試劑均為市售分析純或生物試劑.

2 結果與分析

2.1 供試菌株篩選分離純化篩選培養基以苯乙酮作為唯一碳源,獲得菌落形態各異的菌株共224株,同本實驗保存的34酵母菌一起作為R-苯乙醇高產菌株的供試菌.

2.2 苯乙醇高產菌株篩選應用搖瓶培養配合TLC檢測方法,初步挑選在硅膠板上形成的斑點直徑大且顏色深的8株菌進行氣相色譜分析(圖1).其中,菌株cmq6-8的結果最好,GC檢測顯示,cmq6-8可將苯乙酮不對稱合成的R-苯乙醇,底物轉化率為49.42%,產物對映體過量值為94.81%.

圖1 氣相色譜檢測cmq6-8催化苯乙酮的不對稱反應Fig.1 Gas chromatography(GC)of reduction products by cmq6-8

2.2 催化穩定性研究將cmq6-8連續傳20代,并分別考察子1代、子5代、子10代、子15代、子20代菌株對底物苯乙酮的不對稱催化能力,結果顯示底物轉化率及產物的對映體過量值變化不大,分別為50% ±1.65%,95% ±0.87%(圖2),說明菌株cmq6-8催化活性相對穩定,具有工業化應用的潛力.

圖2 菌株傳代次數對cmq6-8不對稱還原苯乙酮影響Fig.2 Effects of strain generations on the asymmetric reduction of acetophenone by cmq6-8

2.3 形態學觀察及部分生理特征菌株cmq6-8的菌落成圓形、邊緣整齊、乳白色、不透明、有光澤、質地軟;顯微鏡下菌體細胞呈卵圓形、無菌絲體、未見出芽,有子囊孢子、有擲孢子產生;糖發酵試驗:麥芽糖+,葡萄糖+,乳糖-;碳源同化試驗:麥芽糖+,乳糖V,甘露醇V;未形成類淀粉化合物;在葡萄糖濃度為50%時菌體未生長;可以分解尿素.

2.4 26SrDNAD1/D2區域序列分析PCR獲得了菌株cmq6-8的26SrDNAD1/D2區域基因的部分片斷,利用BLAST軟件將該序列與GenBank中收錄的DNA序列進行比對,并與相關菌種構建進化樹(圖3).圖中顯示cmq6-8與解脂耶氏酵母ATCC 18942(AF335986)聚成一支,序列同源性﹥99.00%,表明兩者親緣關系最近.菌株cmq6-8的26SrDNAD1/D2區域序列長度為593 bp,其在Gen-Bank數據庫中的登陸號為JQ689945.

3 討論

在生物合成手性芳香酮的相關研究中,將底物分子中的羰基不對稱還原生產光學活性手性醇是一條有效途徑,其中研究最為廣泛的底物就是羰基兩側分別具有苯基和烷基的物質,因此苯乙酮被視為最理想的模式底物,是檢測還原性生物催化劑的立體化學傾向性底物分子[16].本文以苯乙酮誘導底物,從自然界中篩選可以苯乙酮為唯一碳源,且對有機溶劑耐受的微生物,結果獲得一株解脂耶氏酵母cmq6-8,其催化產生的產物為R-苯乙醇.解脂耶氏酵母是非常規酵母菌的典型代表,它的最大特點就是底物范圍較廣,目前常被用于研究油脂廢水的生物防治,而利用解脂耶氏酵母進行不對稱催化的相關報道較少.在以菌株cmq6-8全細胞為催化劑,不對稱還原苯乙酮合成R-苯乙醇的反應中,當底物苯乙酮的質量分數為108 mmol/L時,靜息細胞量為0.25 g/mL,添加的輔助底物葡萄糖質量分數為2%,轉化體系初始pH值為7,30℃轉化48 h時,底物轉化率為49.42%,產物R-苯乙醇的對映體過量值為94.81%.下一步將通過發酵條件和轉化條件優化等手段進一步提高底物的轉化率及產物的對映體過量值,為該方法的工業化提供理論及技術依據.

圖3 基于26SrDNA D1／D2區域序列和鄰接法構建的系統發育樹Fig．3 Phylogenetic tree based on 26SrDNA D1／D2 domain sequences constructed with the neighbor-joining method alignment

另外,本實驗將薄層色譜TLC引入R-苯乙醇產生菌株的篩選工作中,結果表明TLC檢測雖然只是一種定性檢測方法,但樣品在薄層板上顯色的深淺及斑點的大小都與底物的轉化率呈正相關.因此,可優先選擇硅膠板上直徑較大、顏色較深斑點的菌株進行GC色譜檢測,這不僅可有效的減少復篩的工作量,而且縮短篩選周期,是一項有益的嘗試.

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