A型禽偏肺病毒F蛋白的原核表達與抗原性分析

閻 旭，韋 莉，王 菁，朱姍姍，張春燕，柳舒航，全 榮，李子璇，劉 浩，劉 爵

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 塘沽 300457；2.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 海淀 100097）

禽偏肺病毒病(Avian metapneumovirus，aMPV)是指由偏禽肺病毒引起的一種以禽呼吸道癥狀、頭部腫脹和產蛋率下降為主要特征的疾病。禽偏肺病毒又稱火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)，感染火雞后可引起溫和或中度上呼吸道感染-火雞鼻氣管炎(TRT)；也可引起雞的溫和型上呼吸道或中樞神經系統疾病-腫頭綜合征(SHS)。禽偏肺病毒屬于副黏病毒科、肺病毒亞科、肺病毒屬，于1978年首次發現于南非共和國,隨后從法國、英國、中國臺灣、日本等國家和地區的呼吸道疾病或SHS發病雞中分離到aMPV。1998年沈瑞忠[1]等人在我國黑龍江某肉雞場的SHS雞群中分離到了APV/Chick?en/China/1/98株。

1997年，在美國科羅拉多州首次分離到與歐洲等一些國家報道的毒株不同的aMPV，命名為aMPVC。根據吸附糖蛋白G蛋白核苷酸序列分析和單克隆抗體中和試驗，aMPV分為A、B、C、D四個亞型。aMPV-A和aMPV-B主要分布在歐洲和南非，aMPVC感染以美國為主，aMPV-D僅在法國可檢測到。通過特異性單克隆抗體中和試驗檢測表明，aMPV-C與aMPV-A、aMPV-B之間沒有明顯的血清學關系。一般情況下，aMPV-A和aMPV-B之間蛋白結構的同源性為70%～90%，二者與aMPV-C之間的同源性則為40%～70%，而aMPV-C與hMPV之間的蛋白結構比其他亞型更相似。

禽偏肺病毒是一種不分節段的單股負鏈RNA病毒，病毒粒子具有多形性，一般呈橢圓形，偶爾也有圓形或長線狀形，直徑80～300 nm，核衣殼大小約為15 nm，有囊膜，表面纖突長約13～15 nm[2]。aMPV共有8種結構蛋白，3種膜蛋白[3-5]，即融合蛋白F、小疏水蛋白SH和糖蛋白G，其中F蛋白誘導與病毒包膜與宿主細胞質膜的融合，又稱為融合蛋白。病毒包膜與細胞質膜的融合是把核衣殼傳遞到細胞質中，隨后感染細胞，在感染的細胞質膜中表達的F蛋白可以介導與鄰近細胞質融合形成合胞體[6-7]，合胞體可能是病毒傳播的機制。F蛋白為I型膜蛋白，編碼540～580個氨基酸，研究表明，F蛋白是偏肺病毒宿主嗜性的主要決定因素[14]。本試驗的目的是利用可溶性的大腸桿菌系統表達aMPV F基因，為今后的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種、酶類及其他試劑 Pcmv-myc-L質粒本實驗室保存；pBCX載體謝青梅博士惠贈。基因工程宿主菌E.coli DH5α，TaKaRa公司購買；表達菌E.coli BL21（DE3）博邁德生物公司購買。PrimeSTAR HS DNA Polymerase，購自 TaKaRa公司；Trans2K DNA Marker，購自Transgen公司；快速凝膠回收試劑盒和小量質粒DNA提取純化試劑盒，購自Omega公司；限制性內切酶HindⅢ、Kpn I和磷酸酶抑制劑，購自NEB公司；QIAquick PCR Purification Kit，購自Qiagen公司；T4 DNA連接酶，購自Fermentas公司；IPTG、Amp、溴化乙錠（EB），購自寶泰克生物科技有限公司；6×His-Tag融合蛋白親和層析Ni-NTA凝膠，購自德國Qiagen公司。

1.2 F基因的擴增、回收 根據GenBank上發表的A型aMPV F蛋白基因序列，用Oligo 6.0軟件設計一對特異性引物(F1/F2)，F1：5′-GG GGTACC GAG?GCAGTATCCACATTAGGG-3′，F2：5′-CCC AAGCTT CTTGGCATCTGCACCTAG-3′。其擴增片段長度為1023 bp，以Pcmy-myc-L作為模板取0.2μL，加入上下游引物F1、F2各1μL，2.5 mmol/L dNTP 2μL，5×Buffer4μL，Prime STAR 0.2μL，加ddH20至20μL。PCR反應循環程序如下：95℃預變性5 min，94℃30 s，59℃1.5 min，循環35次，最后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，OMEGA公司快速凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.3 重組質粒的構建與鑒定 回收的F基因經HindⅢ和KpnⅠ酶切，克隆至pBCX載體中，構建pBCX/AMV/A/F。將其轉化入感受態BL21（DE3）中，鑒定為陽性的單菌落，加入終濃度分別為0.8、1.0、1.2 mmol/L IPTG進行誘導表達，確定最適誘導條件。

1.4 目的蛋白的可溶性分析、純化及鑒定 參照確定的最適誘導條件，IPTG誘導表達4 h，離心收集菌體冰浴條件下超聲破碎，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析。按照Qiagen純化蛋白試劑盒說明，在非變性的條件下，將1000 mL經IPTG誘導4 h后的菌液，取菌體裂解、離心，將上清通過Ni-NTA柱，收集洗脫液，并測蛋白濃度。將純化所得蛋白分別進行SDS-PAGE電泳和WB。常規制備樣品，12%SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉移至NC膜上，封閉NC膜，PBST洗膜3次，加入1∶800稀釋的一抗溶液，室溫孵育2 h，PBST液洗膜3次，放人1∶8000稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG二抗中，室溫孵育1.5 h，PBST液洗膜3次，每次10 min。把NC膜浸入到配好的底物溶液中顯色，出現顏色時，立刻用蒸餾水沖洗終止反應，拍照。

2 結果

2.1 F基因的PCR擴增結果 用所設計的F1/F2引物進行PCR擴增，從Pcmy-myc-L質粒中擴增的PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳時，可以見到長約1023 bp左右的電泳條帶，大小與預期的相吻合（圖1）。

圖1 F基因的PCR擴增

2.2 重組質粒的酶切與PCR鑒定結果 挑取轉化后的單菌落進行PCR鑒定，擴增到長約1023 bp的片段（圖2）。aMPV-F基因PCR產物經純化酶切后，插入pBCX載體的外源基因插入位點，構成重組質粒pBCX-F（圖3）。

圖2 單菌落PC R鑒定

圖3 重組質粒酶切鑒定

2.3 SDS-PAGE分析結果 取菌液接種到LA液體培養基中，37℃220 r/min離心振搖培養，待細菌濃度達到OD600為0.4～0.5時加入IPTG并使其終濃度達1 mmol/mL，取不同小時誘導的菌液進行SDS-PAGE檢測，表達產物如圖4所示，直接將融合蛋白細菌裂解上清用QIAGEN NI純化柱純化，在Clution Buffer洗脫液中含有目的融合蛋白，如圖5所示。

圖4 融合蛋白表達產物的S D S-PA G E檢測

圖5 融合蛋白純化S D S檢測

圖6 表達重組蛋白的W estern-blotting鑒定

2.4 Western-blotting分析結果 經SDS-PAGE電泳，利用Western-blotting對純化的aMPV F融合蛋白進行特異性鑒定。結果在預定的74 kDa上方處有一條較深的顯色帶，說明重組F蛋白具有抗原活性，大小與SDS-PAGE表達的蛋白大小一致。該結果證實了用載體pBCX表達的融合蛋白F均具有免疫活性。

3 討論

目前我國是世界上第一養雞大國，雞的飼養量96億只，每年因各類禽病帶來的死亡率高達20%～25%，損失數百億人民幣。因此，研制特異、靈敏、簡便的診斷試劑盒是我國當前防控疫病的迫切需求。在眾多的表達系統之中，大腸桿菌表達系統是目前應用最為廣泛的經典表達系統，具有結構簡單、易操作、成本低廉的優點。本試驗進行了A型aMPV F基因在大腸桿菌系統中的表達，所選取的表達載體pBCX是pet-43.1載體插入了msyB基因作為融合伴侶的改造載體，msyB基因編碼蛋白是大腸桿菌本身的蛋白，是一種高可溶性多肽，本身在大腸桿菌中表達量很高，其作為載體蛋白具有穩定性、可溶性和表達水平高的特性；pBCX載體有6×His融合標簽，有腸激酶的裂解位點，便于檢測和純化所表達的重組融合蛋白，本試驗表達的F蛋白具有免疫原性，可以直接作為免疫原免疫動物，也可以純化之后免疫動物，或與佐劑配合之后免疫動物。為了減少免疫的副作用，也可以用腸激酶處理該融合蛋白，將目標蛋白與伴侶蛋白裂解，收集、純化目標蛋白，用目標蛋白作為抗原免疫動物。

本試驗僅是初步探索了aMPV F基因在大腸桿菌中的表達情況，為更加深入地研究aMPV F基因的功能及其他重組蛋白的表達提供了參考，aMPV F基因在大腸桿菌中的成功表達為aMPV診斷抗原及基因工程疫苗的研制奠定了基礎。

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