復方中藥-益生菌生物控制劑的研制及其對斷奶仔豬的影響

席 磊 ，鄭 鳴，王永芬，邊傳周

（河南牧業經濟學院，河南 鄭州 450011）

豬致病性大腸桿菌是獸醫學臨床感染中最常見的病原菌之一，抗生素在該病防治中的長期使用和濫用，產生的耐藥性、藥物殘留、動物自身免疫力降低以及對生態環境潛在危害等弊端日趨明顯[1-2]。益生菌、中藥作為新型的綠色飼料添加劑，以天然無毒、無副作用、無殘留等優勢，正在成為抗生素的替代品，受到養殖業青睞，是凈化養殖場環境，實現可持續發展的必然選擇[3-6]。目前市售中藥、益生菌產品，存在以下問題：一是缺乏針對特定豬場或區域病原菌開展優勢益生菌株與高效中藥篩選；二是產品多采用單一菌株、單方中藥或復合菌株、復方中藥等形式，對兩者協同使用產品開發較少；三是產品應用停留在疾病防治層面，沒有考慮到菌株多重耐藥性逆轉與環境凈化問題。通過質粒消除作用實現菌株耐藥性逆轉，是目前解決菌株耐藥性的研究熱點[7]。研究表明，不少中藥在其抗菌消炎的基礎上，還有消除細菌耐藥性質粒的作用[8]。

本試驗在前期針對87株豬致病性大腸桿菌開展的不同生物制劑對其抑菌效果、不同中藥對其耐藥性質粒消除作用等試驗基礎上[1，8]，以石榴皮、黃芩、黃連等3種中藥和乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌等2株益生菌為材料，制備復方中藥-益生菌生物控制劑，在斷奶仔豬中進行應用研究，旨在為利用生物制劑控制豬大腸桿菌病發生、實現菌株耐藥性逆轉提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 益生菌、中藥 黃連、黃芪、石榴皮，購自鄭州中藥批發市場；乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌，由河南牧業經濟學院微生物實驗室提供。

1.2 培養基 營養瓊脂、普通肉湯、LB等培養基，均購自北京奧博星生物技術責任有限公司。

1.3 抗菌藥標準品 諾氟沙星(NOR)、環丙沙星(CIP)、四環素(TC)、復方新諾明(SXT)、強力霉素(DOX)、氨芐西林(AM)、鏈霉素(SM)等 7 種藥敏紙片，購自北京天壇生物技術有限公司；藥敏試驗質控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，購自中國獸醫藥品監察所。

1.4 主要儀器 中藥多功能提取罐：上海達程試驗設備有限公司；BMR系列中試發酵罐(50 L)，上海傲中生物工程設備有限公司；核酸電泳系統：上海禾工科學儀器有限公司；Enduro GDS凝膠成像系統：美國Labnet公司。

1.5 復方中藥煎劑的制備 將石榴皮、黃芩、黃連等3種中藥按劉玉慶等[9]方法，以2∶3∶5比例,采用煎煮法提取，使藥液中生藥含量均為1 g/mL，滅菌，4℃保存備用。

1.6 復方益生菌制劑的制備 按王永芬等文獻[10]方法，分別制備乳酸桿菌與枯草芽孢桿菌制劑，1∶1混合制備復合益生菌制劑4℃保存。用稀釋平板法檢測產品活菌數(CFU/g)。

1.7 復方中藥-益生菌生物控制劑對斷奶仔豬生長性能與腹瀉預防效果

1.7.1 試驗動物的選取與飼喂 選擇日齡相同、體重相近的19日齡健康三元雜交仔豬16窩，編號依次為1～16，每4窩為1組，隨機分為4組。依次為對照組（CK）、試驗1組（復方中藥制劑組）、試驗2組（復方益生菌制劑組）、試驗3組（復方中藥-益生菌生物控制劑組）。在常規日糧基礎上，各試驗組采用濕拌料，復方中藥制劑10mL/kg、復方益生菌制劑10 g/kg，每日添加3次。添加時間為19～28日齡。對照組、試驗組均按豬場常規飼養管理方式飼養，斷奶時間為28日齡。

1.7.2 試驗地點與觀察時間 試驗在河南安陽某豬場進行，觀察時間從19日齡開始到42日齡。

1.7.3 測定指標 仔豬日增重、料重比、腹瀉率、腹瀉頻率和死亡率。其中腹瀉率（%）=腹瀉頭數/總頭數×100；腹瀉頻率（%）=Σ(腹瀉仔豬頭數×仔豬腹瀉天數)/(供試豬總頭數×試驗天數)×100。血清免疫指標測定，分別在19日齡、28日齡、35日齡和42日齡，每組隨機選取5頭仔豬采血，用IgG非特異性抗體試劑盒進行檢測。

1.8 豬場環境中致病性大腸桿菌耐藥性質粒消除與耐藥性逆轉的測定 19、28、42日齡分別在各組圈欄內各采集5個糞樣，分離致病性大腸桿菌，進行耐藥性試驗、耐藥性質粒提取檢測，比較不同階段菌株耐藥性與所含質粒數量。

1.9 豬糞中氨氣釋放量的測定 19、28、42日齡分別在各組圈欄內各采集5個糞樣，按照李萬軍等[11]方法測定氨氣釋放量。

1.10 數據處理 用SPSSV19.0對試驗數據進行處理和統計分析，進行F檢驗，并用Duncan′s法多重比較。

2 結果與分析

2.1 復方益生菌制劑活菌數的檢測 經檢測制備的乳酸桿菌益生菌制劑、枯草芽孢桿菌益生菌制劑、乳酸桿菌-枯草芽孢桿菌復合益生菌制劑中的活菌數分別為8.29×108、6.79×109、8.97×108CFU/g。

2.2 復方中藥-益生菌生物制劑對斷奶仔豬生長性能與腹瀉預防效果

2.2.1 對斷奶仔豬生產性能與腹瀉預防的影響由表1可知，試驗各組日增重顯著高于對照組（P＜0.05），料重比、腹瀉率、腹瀉頻率均顯著低于對照組（P＜0.05）。試驗3組日增重較試驗1組、2組分別提高23.03%（P＜0.05）和 20.65%（P＜0.05）；料重比分別下降21.46%（P＜0.05）和18.10%（P＜0.05）；腹瀉頻率分別下降65.23%、54.12%（P＜0.05）。說明復方中藥-益生菌生物控制劑對斷奶仔豬生產性能的提高和腹瀉預防的效果顯著優于中藥制劑和復方益生菌制劑組。

2.2.2 對斷奶仔豬血清中IgG含量的影響 由表2可知，隨著生物控制劑飼喂時間的增加，各試驗組IgG含量呈上升趨勢；到42日齡時，試驗3組IgG含量較試驗1組、試驗2組，分別提高了62.29%、17.44%（P＜0.05）。說明復方中藥-益生菌生物控制劑能較好地提高仔豬血清中IgG的含量。

表1 復方中藥-益生菌生物控制劑對斷奶仔豬的影響 （Means±SD）

表2 復方中藥-益生菌生物控制劑對斷奶仔豬血清中Ig G含量的影響 （Mean±SD）

2.3 豬場環境中致病性大腸桿菌耐藥性質粒消除與耐藥性逆轉的測定

2.3.1 豬場環境中致病性大腸桿菌耐藥性質粒消除的測定 由表3可知，分離到的豬致病性E.coli菌株都含有質粒，但不同時間、不同試驗組中菌株質粒數有較大差異。隨著生物控制劑飼喂時間的增加，分離到菌株數量和菌株所含的平均質粒數都呈下降趨勢，各試驗組的質粒平均消除率分別為39.22%、6.25%、46.51%。說明復方中藥-益生菌生物制劑對豬致病性大腸桿菌具有較好的質粒消除作用。

表3 豬場環境中大腸桿菌耐藥性質粒消除的測定

2.3.2 豬場環境中致病性大腸桿菌耐藥性逆轉的測定 由表4可知，18日齡時各組分離到的致病性大腸桿菌對7種抗生素平均敏感率分別為7.09%、7.14%、6.96%、7.15%（P＞0.05）；經過不同生物制劑飼喂添加后，各試驗組平均敏感率較對照組分別提高31.65%、22.40%和57.66%。

表4 豬場環境中大腸桿菌耐藥性逆轉的測定

2.4 豬糞中氨氣釋放量的測定 由表5可知，復方中藥制劑、復方益生菌制劑、復方中藥-益生菌生物控制劑的持續添加可以顯著降低氨氣的排放量，以復方中藥-益生菌生物控制劑效果最佳，較對照組降低約50%。

表5 發酵豬糞中氨氣釋放量的測定

3 討論

3.1 豬致病性大腸桿菌耐藥性是豬大腸桿菌病防控的難點[12]。本試驗在前期對87株豬致病性大腸桿菌具有質粒消除作用的中藥篩選試驗基礎上，制備了以質粒消除為主導、兼有抗菌作用的石榴皮、黃芩、黃連復方中藥質粒消除劑；為了達到預防治療豬大腸桿菌病的目的，以前期試驗篩選出的乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌為材料，制備復合益生菌制劑，二者協同使用，不僅提高了動物的生長性能和血清中IgG含量，而且對耐藥性質粒具有消除作用，使菌株耐藥性得以逆轉，控制了耐藥菌的產生。

3.2 控制和減少養豬生產中氨的釋放量，是畜牧業可持續發展的需要。本試驗制備的復方中藥-益生菌生物控制劑，在結合中藥和益生菌分別作為綠色飼料添加劑優勢的基礎上，利用中藥能為益生菌的增殖掃除障礙，益生菌可以促進動物體對中藥的消化吸收等協同作用效果，使飼料消化率得以大幅度提升，使豬糞中氨氣釋放量降低了約50%，對凈化豬場環境起到了積極的作用。

3.3 試驗表明，中藥、益生菌的聯合使用，具有較好的協同作用，但它們之間的關系不是簡單的疊加，而是復雜的組合效應，其機理還有待進一步研究。同時，本試驗中復方中藥-益生菌生物控制劑使用是針對仔豬免疫生理特點、斷奶應激而初步設立的。如何改進中藥、益生菌復配比例、添加比例、飼喂時間等，使復方中藥-益生菌生物控制劑在整個豬生產過程中發揮最大效益，將是我們下一步開展的研究工作。

[1] 王永芬，席磊，趙志軍，等.不同生物制劑對豬致病性大腸桿菌的體外抑菌試驗[J].云南農業大學學報，2012，27(1)：60-66.

[2] 舒蕾，萬莉，張琦，等.四川某些規模化豬場大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性監測[J].中國獸醫雜志，2012，48（3）：32-34.

[3] RossGR，Gusils C，Gloria R，etal.Effects of probiotic adminis?tration in swine[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2010，109(6)：545-549.

[4] SignoriniM L，Soto L P，Zbrun M V，et al.Impact of probiotic administration on the health and fecal microbiota of young calves：A meta-analysis of randomized controlled trials of lactic acid bacteria[J].Research in Veterinary Science，2012，93(1)：250-258.

[5] 陸銀，武旭峰，費擁軍，等.復合益生菌對肉仔雞的生長性能及屠體品質的影響[J].中國畜牧雜志，2013，49(1)：51-53.

[6] 肖莉春，孔祥峰，郭小權.中藥抑菌成分及其在養豬生產中的應用前景[J].動物營養學報，2012，24(12)：2311-2318.

[7] 沈永恕，張春輝，荊新蕊，等.大腸埃希氏細菌中ESBLs耐藥質粒的傳播與消除研究[J].西北農林科技大學學報(自然科學版)，2010，38(2)：41-46.

[8] 王永芬，席磊，邊傳周，等.豬致病性大腸桿菌耐藥質粒檢測及其中藥消除作用研究[J].中國預防獸醫學報，2011，33(12)：932-935.

[9] 劉玉慶，李曄，車程川，等.大腸桿菌對中草藥敏感性試驗及其方法研究[J].中獸醫醫藥雜志，2003，22(1)：3-5.

[10] 王永芬，趙志軍，席磊，等.單一菌種與復合菌種益生菌制劑對蛋雞生產效果研究[J].中國畜牧獸醫，2011，38(11)：28-31.

[11] 李萬軍，張德威.益生菌對蛋雞生產性能及雞舍空氣環境的影響[J].黑龍江畜牧獸醫，2012，2：71-72.

[12] 蘇海峰，蔣月，徐國鋒，等.哈爾濱周邊地區豬源致病性大腸桿菌耐藥性分析[J].中國獸醫雜志，2012，48(6)：46-49.