Gh relin對豬小腸上皮細胞增殖的影響

孔志偉，姜明鑫，郭 楠 ，楊文艷 ，楊連玉

（吉林農業大學動物科技學院，吉林 長春 130118）

Ghrelin[1]是近年來新發現的由28個氨基酸組成的內源性肽，是迄今發現的惟一的生長激素促分泌激素受體（growth hormonesecretagogues receptor，GHSR）的天然配體。Ghrelin與其配體結合不僅能夠促進垂體在體內和體外分泌生長激素[1-2]，而且還與采食行為以及能量代謝的平衡有關[3-7]。研究發現，外源性的Ghrelin能夠提高小腸內外源性Ghrelin基因的表達。15μg/kg的胃內Ghrelin能夠顯著增強小腸內細胞的增值率，降低細胞凋亡率[8]，并且有研究顯示結果與這一說法相一致[9-13]。小腸是食物進行消化、吸收的主要場所，研究Ghrelin對小腸上皮細胞生長發育的影響能夠進一步了解Ghrelin代謝的過程。該試驗通過體外培養的方法，對添加不同濃度梯度的Ghrelin對小腸上皮細胞的增殖情況進行分析，從而了解Ghrelin對豬小腸上皮細胞增殖的作用，為深入的研究Ghrelin對小腸上皮細胞影響的機制奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器 分光光度計 (BIO RAD680，美國)；二氧化碳培養箱（SELECTA，西班牙）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；高壓蒸汽滅菌鍋（SAN?YO，日本）；超凈工作臺（SANYO，日本）；水平搖床(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司HZS-H)；鼓風干燥箱（上海申賢恒溫設備廠）。

1.2 試驗試劑 DMEM/F12培養基（GIBCO），胎牛血清（PAA），谷氨酰胺和胰蛋白酶均為AMRESCO產品；青霉素、鏈霉素均為Sigma產品；0.25%胰蛋白酶，膠原酶Ⅳ，MTT（Sigma）,二甲基亞砜（Sig?ma），Ghrelin（北京拜威佑生養殖管理咨詢機構）。

1.3 細胞來源 試驗所用細胞來自于動物生產與產品質量安全教育部重點實驗室（吉林農業大學）。

1.4 試驗方法

1.4.1 條件培養液的配制 配制Ph=6.4的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，然后將Ghrelin溶解其中配制成3×10-5mol/L的濃縮液，上述操作遵照Ghrelin說明書。用10%DMEM-F12溶液稀釋上述濃縮液為1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L、1×10-10mol/L各10mL。保存在4℃冰箱中備用。

1.4.2 Ghrelin的添加 將傳5代體外培養的小腸上皮細胞用0.25%胰酶消化，然后用含10%胎牛血清的培養液配成細胞懸液，接種于6個96孔板中，每孔200 μL，細胞濃度為2×104，培養箱中培養，24小時后取出一板，檢測細胞同步化情況。共兩個處理組：Ghrelin組和對照組。Ghrelin組加入終濃度為1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L、1×10-10mol/L的Ghrelin液，對照組僅有等量細胞液。各孔均補足培養液至200μL，37℃，5%CO2培養箱中培養。

分別于第1、3、5、7、9天各取出一板，于孔板內加入MTT 20μL，置于37℃，5%CO2培養箱中培養4 h，后取出96孔板，吸出培養液，每孔加入DMSO 50μL，在空白孔中加入DMSO 50μL作為空白對照，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。用分光光度計，選擇490 nm波長，測定各孔的吸光值，記錄結果，繪制細胞生長曲線。

2 數據處理與分析

采用SPSS17.0軟件對試驗數據進行方差分析和用LSD法進行兩因素多水平間的多重比較，數據用均值±標準差表示。

3 結果

Ghrelin對豬小腸上皮細胞增殖的影響 試驗組1×10-7mol/L濃度時在1～3 d時增殖較快（P＜0.01），刺激后第5天達到增值高峰（P＜0.05），1×10-6mol/L濃度時在3～5 d時增殖較快，其余各濃度組對豬小腸上皮細胞的增殖既無明顯促進作用，也無明顯抑制作用（見表1）。

表1 Ghrelin不同濃度處理組的細胞活性

圖1 刺激后各濃度組細胞生長曲線

4 討論

在人和鼠，Ghrelin的表達以胃組織中為最多，另在下丘腦、小腸、大腸、胰腺和胎盤等也有表達[14]。體外培養條件下,人和鼠Ghrelin均可直接刺激GH在豬垂體前葉細胞的釋放[15]。研究Ghrelin的分泌規律及其作用機制，對于研究豬的生長調控等有著重要的作用。該試驗在體外培養的條件下以傳代培養的豬小腸上皮細胞（車東升等，2010[16]）為材料。參照苗艷穎等(2005)[17]、何紅晨等(2006)[18]研究設計Ghrelin添加水平。該試驗結果顯示，在添加不同濃度Ghrelin時，1×10-6mol/L-1×10-7mol/L組的增殖效果顯著（P＜0.05），細胞的數量也是最多，并且在第5天時達到增值高峰。而以往的研究顯示，10-7～10-15mol/LGhrelin作用24 h能夠明顯促進前脂肪細胞的增殖[19]；10-7mol/LGhrelin能夠顯著促進胰島素β細胞的增殖[20]，10-10mol/LGhrelin能夠極顯著的促進人成骨細胞的增殖[18]。Ghrelin對小腸的作用或許是由于外源性的Ghrelin促進了腸內Ghrelin的表達，從而調節生長激素的分泌，進而促進小腸上皮細胞的增殖；也或許是Ghrelin受體基因mRNA的表達增多，與外源性的Ghrelin作用，對小腸作用的Ghrelin量增多，間接的引起生長激素的分泌，引起腸上皮細胞的增殖；還可能是通過內分泌或者是旁分泌的形式作用于生長激素釋放激素受體，從而促進小腸上皮細胞的增殖。近年來，對Ghrelin的研究逐漸增多，但是對于Ghrelin的分泌調節機制仍不清楚。

[1] Kojima M，Hosoda H，Nalazato M，et al.Ghrelin is growth-hor?mone-releasing acylated peptide from stomach[J].Nature，1999，402(6762)：656-660.

[2] YamazakiM，Nakamura K，Kobayashi H，et al.Regulational ef?fect of ghrelin on growth hormone secretion from perifused rat anterior pituitary cells[J].Neuroendocrinol 2002，14：156-162.

[3] Tschop M，Smiley D L，Heiman M L.Ghrelin induces adiposity in rodents[J].Nature，2000，407：908-913.

[4] Tschop M，Weyer C,Tataranni P A，Devanarayan V，Ravussin E，Heiman M L.Circulating ghrelin levels are decreased in hu?man obesity[J].Diabetes，2001，50：707-709.

[5] W ren A M，Small C J，Ward H L，et al.The novel hypothalamic peptide ghrelin stimulates food intake and growth hormone secre?tion[J].Endocrinology，2000，141：4325-4328.

[6] Nakazato M，Murakami N，Date Y，et al.A role for ghrelin in the central regulation of feeding[J].Nature，2001，409：194-198.

[7] ShintaniM，Ogawa Y，Ebihara K，et al.Ghrelin,an endogenous growth hormone secretagogue，is a novel orexigenic peptide that antagonizes leptin action through the activation of hypothalamic neuropeptide Y/Y1 receptor pathway[J].Diabetes，2001，50：227-232.

[8] Monika S?upecka,Jaros?aw Woliński，Stefan G.Pierzynowski.The effects of enteral ghrelin administration on the remodeling of the small intestinal mucosa in neonatal piglets[J].Regulatory Peptides，2012(174)：38-45.

[9] Andreis P G，Malendowicz L K，Trejter M，et al.Ghrelin and growth hormone secretagogue receptor are expressed in the rat adrenal cortex：evidence that ghrelin stimulates the growth,but not the secretory activity of adrenal cells[J].FEBS Lett，2003，536：173-179.

[10] Kim M S，Yoon C Y，Jang PG，et al.The mitogenic and anti?apoptotic actions of ghrelin in 3T3-L1 adipocytes[J].Mol Endo?crinol，2004，18：2291-2301.

[11]Nanzer AM，Khalaf S，Mozid AM，etal.Ghrelin exerts a prolif?erative effecton a rat pituitary somatotroph cell line via themito?gen-activated protein kinase pathway[J].Eur J Endocrinol，2004，151：233-240.

[12] Rak-Mardyla A，Gregoraszczuk E.Effectof ghrelin on prolifera?tion,apoptosis and secretion of progesterone and hCG in the pla?cental JEG-3 cell line[J].Reprod Biol，2010，10：159-165.

[13]Waseem T，Duxbury M S，Ito H，etal.Ghrelin：a novel humoral mediator of intestinal adaptation[J].Gastroenterology，2004，126：136.

[14] 楊連玉，楊文艷，冀鳳潔，等.豬Ghrelin的基因克隆及其組織中mRNA分布的研究[J].吉林農業大學學報，2004，26(1)：86-88.

[15] Hashizume T，HoriuchiM，Tate N，et al.Effects of Ghrelin on growth hormone secretion from cultured adenohypophysial cells in pigs[J].Domest AnimEndocrinol，2003，24(3)：2092-2181.

[16] 車東升，劉飛飛，穆成龍，等.豬小腸上皮細胞的分離培養研究[C].第六次全國飼料營養學術研討會論文集，西安：中國畜牧獸醫學會動物營養學分會，2010：525.

[17] 苗艷穎，侯忠赤，翁良，等.Ghrelin促進PC12細胞增殖的機制研究[C].中國神經科學學會第六次學術會議暨學會成立十周年慶祝大會論文摘要匯編，重慶：中國神經科學學會，2005：45.

[18] 何紅晨.Ghrelin對人成骨細胞增殖與功能的影響[D].成都：四川大學，2006.

[19] 劉靜，林漢華，程佩萱，等.Ghrelin對3T3-L1前脂肪細胞增值和分化的影響及其相關機制的探討[J].中國當代兒科雜志，2009，11(1)：69-73.

[20] 劉榮鳳，張捷，胡曉舟，等.Ghrelin促進胰島β細胞增殖的實驗研究[C].中華醫學會第七次全國檢驗醫學學術會議資料匯編，濟南：中華醫學會、中華醫學會檢驗分會，2008：1271.