江蘇安徽地區鵝源沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析

査 華，石火英，尚 竟，晉海云，劉 伊，王 婉

（揚州大學獸醫學院病理教研室禽類預防醫學教育部重點實驗室，江蘇 揚州 225009）

沙門菌是一種對人和動物都非常重要的致病菌，它不但可引起多種畜禽疾病，造成全身性敗血癥和腸炎，還可以作為食源性疾病的病原體，引起人類胃腸炎和食物中毒[1,2]。禽源沙門菌是嚴重危害我國禽業的重要傳染病，可造成種蛋孵化率、雛禽存活率和禽生產性能下降等問題[3]。雞白痢沙門菌是禽源沙門菌中的一種，在各種年齡雞只都可發病?？股厥欠乐坞u白痢重要措施，但抗生素的濫用造成了雞白痢沙門菌的耐藥性逐年上升[4-,5]。雖有文獻報道鵝源沙門菌診斷和防治，但針對鵝源沙門菌的實驗室診斷、分型和耐藥性分析卻較為罕見[6]。本研究對2012年6月-2013年1月江蘇、安徽地區的532份鵝源病料、泄殖腔棉拭子進行了沙門菌的分離，并對鑒定出的15株鵝源沙門菌進行血清型分型及藥物敏感性試驗，以期對鵝源沙門菌新近分離株的流行分布及耐藥性提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 揚州大學動物醫院來源的江蘇、安徽地區鵝源病料，匯集江蘇、安徽地區鵝的揚州市活禽市場所采集的鵝泄殖腔棉拭子。

1.2 質控菌株及主要試劑 藥敏試驗大腸桿菌標準質控菌株ATCC25922，由實驗室保存。沙門菌屬診斷血清(60種)，購自蘭州生物制品研究所；PCR相關試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司；亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液，麥康凱培養基、S.S.培養基（沙門、志賀氏菌屬瓊脂培養基），購自上海生工生物工程技術服務有限公司；腸桿菌科細菌生化鑒定管及成套試劑，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 藥敏紙片 頭孢曲松（30μg），四環素（30 μg），壯觀霉素（100μg），頭孢西?。?0μg），鏈霉素（10μg），氯霉素（30μg），頭孢孟多（30μg），卡那霉素（30μg），復方新諾明（23.75μg），磺胺異噁唑（300μg），羧芐青霉素（100μg），慶大霉素（10 μg），甲氧芐啶（5μg），萘啶酸（30μg），氨芐西林（10μg），頭孢噻肟（30μg），環丙沙星（5μg），阿莫西林-克拉維酸（20μg）等18種藥敏紙片，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 細菌分離、純化及革蘭染色 以常規無菌操作方法剖檢病死雞，取病料、泄殖腔樣品置于SC肉湯中，37℃搖床增菌18～24 h；轉接于麥康凱培養基，置于37℃培養箱培養18～48 h，挑取可疑菌落于S.S.及麥康凱培養基進行分離純化。將純化菌直接涂片，按革蘭染色程序（草酸銨結晶紫液1 min，碘液1min，95%酒精15～30 s，沙黃復染液1 min）操作后，在光學顯微鏡下觀察菌體形態。

1.5 PCR鑒定沙門菌屬 針對沙門菌腸毒素STN基因設計引物，上游引物 P1：5′-CTTTGGTCGTA?AAATAAGGCG-3′，下游引物P2：5′-TGCCCAAAG CAGAGAGATTC-3′[7]。PCR體系為25 μL，模板為純化后的疑似沙門菌單菌落提取的DNA。擴增程序為94℃ 5 min；94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1 min，25個循環；72℃10min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 生化試驗鑒定沙門菌 PCR鑒定為陽性的分離株，進行硫化氫、苯丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖等15種生化指標的測定。

1.7 血清學分型 對STN基因擴增為陽性、生化試驗符合沙門菌特性的分離株，再次純化，涂布于LB培養基，按照中華人民共和國國家標準GB 4 789.4～2010，進行血清型鑒定[8]。

O抗原鑒定：用A-F多價O血清進行玻板凝集實驗，同時設以生理鹽水對照。生理鹽水不凝集而O多價血清凝集者，用O9；O4；O10；O7；O8；O2和O11因子血清做凝集試驗。根據試驗結果，判定O群。

H抗原鑒定：生理鹽水對照為陰性者，進行H多價1、H多價2、H多價3、H多價4血清進行鑒定，對于陽性者，再用對應的H復合血清及H單因子血清逐一檢查，以確定H第一相及第二相H抗原。每一個H抗原成分的最后確定均應根據H單因子血清的檢查結果，沒有H單因子血清的要用兩個H復合因子血清進行核對。

1.8 藥物敏感性試驗 對鑒定出的鵝源沙門菌分離株，通過瓊脂紙片擴散法(Kirby-Bauer,K-B)進行頭孢曲松、四環素、壯觀霉素、頭孢西丁等18種抗菌藥物的敏感性試驗，以大腸桿菌ATCC25922作為質控菌株，按CLSI2009版的標準進行結果判定[9]。

1.9 動物試驗 篩選2株所分離沙門菌優勢菌（雞白痢沙門菌）S1084和S1088，對1日齡SPF雛雞進行致死性試驗，腹腔注射200μL/只（約含菌量1×109CFU），每組10只，并設置陰性對照組，注射后觀察2周，記錄死亡情況，并剖檢死亡雞只，取肝、脾在麥康凱培養基、S.S.培養基進行細菌分離，37℃培養18～48 h，觀察菌落形態并用O9單因子血清進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 分離菌培養特性與形態特征 病料接種后，可見在麥康凱培養基均形成無色、半透明、邊緣整齊、光滑型圓形小菌落；在S.S.培養基形成白色或中心帶黑色的邊緣整齊、光滑、圓形小菌落；革蘭染色鏡檢可觀察到散在排列的紅色短小桿菌，符合沙門菌的特征。

2.2 PCR鑒定結果 在初步分離的疑似沙門菌中，采用針對沙門菌腸毒素STN基因的引物進行PCR擴增，其中有15個分離株基因組DNA中能夠擴增出約260 bp DNA片段，與沙門菌預期擴增結果一致，表明所分離菌中有15株為沙門菌。

2.3 生化試驗 分離株能產生硫化氫，利用木糖、鳥氨酸、賴氨酸、M.R.、葡萄糖產氣、山梨醇，而其余指標如V-P、動力、側金盞花醇等為陰性。

2.4 血清型鑒定 經血清型鑒定，所分離15株沙門菌中，10株為雞白痢沙門菌，2株為德爾卑沙門菌，1株為湯卜遜沙門菌，1株為鼠傷寒沙門菌，1株為里吉爾沙門菌。沙門菌分布情況如表1。

表1 鵝源沙門菌分離株的分布情況

2.5 藥物敏感性試驗結果 所鑒定15個鵝源沙門菌分離株的18種抗菌藥物的藥物敏感性試驗結果顯示，分離株對萘啶酸全部耐藥，對羧芐青霉素、氨芐西林、鏈霉素和磺胺異噁唑也具有很高的耐藥性，耐藥率分別為93.33%、86.67%、80%和80%；而對頭孢曲松、頭孢西丁和卡那霉素耐藥性較低，各抗菌藥物分布菌數及所占比例見表2。除個別分離株耐藥性較低外，86.67%的分離株為多重耐藥菌，且多為7耐菌和8耐菌，表型為TETSTR-SUL-CAR-NAL-AMP-AMX和STR-CE-SULCAR-NAL-AMP-AMX，8耐分離株表型分別為TET-STR-CE-SUL-CAR-NAL-AMP-AMX、SPTSTR-SXT-SUL-CAR-TMP-NAL-AMP和STR-CECAR-TMP-NAL-AMP-CTX-AMX；甚至出現14耐和15耐的高度耐藥菌，分離株表型見表3。

2.6 致死性試驗結果 1日齡雛雞接種S1084和S1088后24 h內即出現死亡，其余死亡雞分布在攻毒后6 d內，而在7～14 d期間未見雞死亡，所攻毒雞的死亡總數分別為10只和8只，陰性對照組雞生長健康。剖檢死亡雛雞，并進行肝和脾的沙門菌分離，在麥康凱和S.S.培養基所培養細菌均符合沙門菌菌落形態，O9血清鑒定純化后細菌，都為強陽性凝集，且健康組雞肝、脾內未分離到細菌，表明攻毒組確為雞白痢沙門菌感染，進而說明鵝源雞白痢沙門菌對雛雞具有很高的致病性。

表2 鵝源沙門菌抗菌藥物分布菌數及所占比例統計

表3 鵝源沙門菌的耐藥表型

3 討論

禽源沙門菌是危害我國養禽業的重要傳染病病原，給家禽養殖和蛋類生產帶來嚴重的經濟損失。目前沙門菌防治以抗生素治療和生物防控為主，但部分地區抗生素的濫用也造成了禽源沙門菌耐藥性的上升。近年來，有報道沙門菌的流行病學和耐藥監測，但針對鵝源沙門菌的流行、亞型分布和耐藥監測卻比較少見[6,10]。本研究通過分子生物學方法與傳統方法結合，對鵝源病料、棉拭子進行沙門菌的分離鑒定和多重耐藥性分析，共鑒定新近鵝源沙門菌15株，陽性率為2.82%，分布于B群、C1群和D群，其中雞白痢沙門菌占多數（66.67%）。藥敏結果顯示，分離株對萘啶酸全部耐藥，對羧芐青霉素、氨芐西林、鏈霉素和磺胺異噁唑耐藥性也很強，由于動物源的沙門菌耐藥機制將會影響人類健康，因此，獸醫臨床工作者應控制抗菌藥物的使用和用量。在全部鵝源沙門菌中，86.67%的分離株為多重耐藥性菌，且耐藥性很強，甚至出現15耐的罕見多重耐藥菌（為德爾卑沙門菌）。值得注意的是，所有鵝源雞白痢沙門菌耐藥性在7耐及7耐以上，其水平傳播很可能使雞具有很高的耐藥性和致病性，既而對養雞業的雛雞繁殖和蛋類生產造成重大經濟損失，故建議進行雞和鵝的分群飼養，并對鵝源雞白痢沙門菌進行長期的耐藥監測。

［1］ NeSBITT A，Ravel A，Murry R，et al.Integrated surveillance and potential sources of Salmonella Enteritidis in human cases in Canada from 2003 to 2009[J].Epidemiol Infect，2012，140(10)：1757-1772.

［2］ Severi E，Booth L，Johnson S，etal.Large outbreak of Salmonel?la Enteritidis PT8 in Portsmouth，U K，associated with a restau?rant[J].Epidemiol Infect，2011，14：1-9.

［3］ Bao H，Zhang H，Wang R.Isolation and characterization of bac?teriophages of Salmonella enterica serovar Pullorum[J].Poult Sci,2011,90(10)：2370-2377.

［4］ Threlfall E J，Fisher IS，Berghold C，et al.Antimicrobial drug resistance in isolates of Salmonella enterica from cases of salmo? nellosis in humans in Europe in 2000： results of international multicentre surveillance[J]. Euro Surveill，2003，8(2)：41-45.

［5］ Pan ZM，Wang X Q，Zhang XM，etal.Changes in antimicrobi?al resistance among Salmonella enterica subspecies enterica se?rovar Pullorum isolates in China from 1962 to 2007[J].Veteri?nary Microbiology，2009，136(3-4)：387-392.

［6］ 金海林，趙權.鵝沙門菌病的診斷與防治[J].中國獸醫雜志，2012，48(2)：87-88.

［7］ 劉蓓蓓.沙門菌PCR檢測方法的建立及其初步應用[D].揚州：揚州大學，2009.

［8］ Popoff M，Le Minor L.Antigenic formulas of the Salmonella se?rovars，WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella[z].World Health Organ，2001.

［9］ Clinical and Laboratory Standard Institute.Performance stan?dards for Antimicrobial Susceptibility Testing[S].Nineteenth In?formational Supplement，2009：M100-S19.

［10］孫化露，姜逸，李樹純，等.動物源性沙門菌的血清型、生物被膜形成能力和耐藥性分析[J].畜牧獸醫學報，2012，43(10)：1630-1638.