犬新鮮精液常溫保存時(shí)間對(duì)精液冷凍效果的影響

楊應(yīng)華，劉小萍，鐘友剛，施振聲

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193）

犬精液冷凍技術(shù)能顯著提高犬繁育效率，在歐美等國(guó)家已經(jīng)取得了廣泛的應(yīng)用。雖然目前世界上沒有一個(gè)統(tǒng)一的冷凍操作規(guī)范，但仍然存在著一些操作慣例。比如人們總是盡快將采集的新鮮精液進(jìn)入冷凍程序，因?yàn)樵隗w外犬精液的質(zhì)量會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而出現(xiàn)下降。然而在實(shí)際操作過程中，從精液采集成功到精液進(jìn)入冷凍操作程序之間的這段時(shí)間是不可避免的。首先精液質(zhì)量的評(píng)估需要一段時(shí)間，其次一些冷凍實(shí)驗(yàn)室與精液采集地可能距離較遠(yuǎn)，這也會(huì)耽誤一定時(shí)間。為了探究延遲時(shí)間對(duì)冷凍效果的影響程度及確定一個(gè)可接受的時(shí)間范圍，本研究調(diào)查了犬新鮮精液在常溫下不同的保存時(shí)間對(duì)精液冷凍效果的影響，以期為實(shí)際操作規(guī)范的制定提供參考。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 共5只公犬（3只中型雜種犬，1只比格犬，1只薩摩耶犬），年齡2～5歲，體況良好，均來自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼喂全價(jià)日糧，不限飲水，每日遛1～2次。

1.2 試驗(yàn)試劑 三羥甲基氨基甲烷（Tris）、一水檸檬酸、果糖、甘油、青霉素、鏈霉素、蛋黃、Equex STM paste（Nova ChemicalSales，Scituate Inc.，MA，USA）、臺(tái)盼藍(lán)染色液、吉姆薩染色液、中性紅、甲醛等。

1.3 主要儀器 日本Olympus公司CX41型相差顯微鏡；以色列Sefi MedicalInstruments公司Makler細(xì)胞計(jì)數(shù)板；德國(guó)Minitube公司，0.5 mL細(xì)管、液氮罐；澳大利亞Cryologic公司，CL-3300程序控溫儀；日本視科特，JL-3001D攝像機(jī)等。

2 方法

2.1 精液采集 手握法采集富含精液段和部分前列腺液段精液，用集精漏斗收集至15 mL離心管中。每次試驗(yàn)共采集5只犬精液，由2人共同完成。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)間隔3 d。

2.2 精液質(zhì)量評(píng)估

2.2.1 密度 將少量精液用蒸餾水稀釋10倍，放置1 min后精子即失去活力，之后移液器吸取10μL于Makler細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.2.2 活力 電腦輔助的主觀測(cè)量。根據(jù)精液密度將精液用生理鹽水適當(dāng)稀釋，之后用Makler細(xì)胞計(jì)數(shù)板在相差顯微鏡20倍物鏡下觀察，配合使用帶有錄制和回放功能的攝像軟件進(jìn)行活力的主觀測(cè)量。每個(gè)樣品鏡下隨機(jī)檢查5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)精子總數(shù)不少于200個(gè)。

精子活力＝直線前行精子數(shù)／總精子數(shù)×100%

2.2.3 質(zhì)膜完整率 采用低滲透壓法（Hypo-osmotic test）進(jìn)行測(cè)量。配置含75 mmol／L果糖和25 mmol／L檸檬酸的低滲透壓水溶液（100 mOsmol／L）。取20μL精液用低滲液稀釋至200μL，在37℃水浴中放置1 h后在相差顯微鏡40倍物鏡下觀察。

質(zhì)膜完整的精子會(huì)出現(xiàn)尾部蜷曲，而質(zhì)膜不完整的精子形態(tài)不發(fā)生變化。前者所占比例即為質(zhì)膜完整率。

圖1 犬精子在低滲液中的相差顯微鏡下觀察 （400×）

2.2.4 頂體完整率 采用改良的臺(tái)盼藍(lán)-吉姆薩復(fù)染色法進(jìn)行測(cè)量[1]。取50μL精液與等體積0.2%臺(tái)盼藍(lán)混合，置于37℃水浴中5 min，制作涂片后用福爾馬林-中性紅溶液固定2 min，然后將風(fēng)干玻片在37℃溫箱中用7.5%吉姆薩染液染色3 h，最后沖洗玻片，待風(fēng)干后油鏡下檢查。

臺(tái)盼藍(lán)染色可鑒別精子死活，吉姆薩染色可區(qū)分頂體完整與否，所以該復(fù)染色法能同時(shí)鑒別精子的死活和頂體完整率。頂體完整率＝頂體完整的活精子／精子總數(shù)

2.3 精液混合，分組 將質(zhì)量合格的精液（活力＞80%）混合均勻，平均分為3份，分別標(biāo)記為對(duì)照組、0.5 h組和1 h組。對(duì)照組立即進(jìn)入冷凍階段，30 min后0.5 h組進(jìn)入冷凍階段，再過30 min后1 h組進(jìn)入冷凍階段。各組進(jìn)入冷凍階段前進(jìn)行精子質(zhì)量評(píng)估。

2.4 精液冷凍 冷凍稀釋液及冷凍步驟大致遵循Linde Forsberg的方法[2]，使用程序溫控儀進(jìn)行降溫。冷凍程序簡(jiǎn)述如下：700 r／min離心5 min，去除上清液，用稀釋液1稀釋精液至4億個(gè)／mL濃度，將精液置于含室溫水的燒杯中后再放入冰箱平衡1.5 h至5℃，再逐滴加入與稀釋液1等體積的稀釋液2，最后再置于冰箱20 min。將精液用吸液器裝入0.5 mL細(xì)管后熱封，再插入程序溫控儀降溫（降溫速率：5℃-20℃-80℃），最后在液氮罐中長(zhǎng)期保存。

2.5 精液解凍和質(zhì)量評(píng)估 精液冷凍保存至少1個(gè)月后，將液氮中的細(xì)管迅速浸沒于37℃水浴中不斷搖動(dòng)。1 min后將凍融精子加入37℃的1 mL解凍液中混勻。在解凍5 min后對(duì)精液的活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率進(jìn)行評(píng)估。。

圖2 犬新鮮精液常溫保存不同時(shí)間對(duì)冷凍前后精液質(zhì)量的影響

表1 稀釋液及解凍液配方（100 mL體系）

2.6 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（17.0.0版本SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）單因素方差分析中的最小差異性顯著法（LSD，Least Significant Difference）進(jìn)行方差分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為有顯著差異。

3 結(jié)果

剛采集的精液平均密度為1.2億／mL，活力86.33%，冷凍前后精液質(zhì)量見表2和圖1

3.1 活力 冷凍前0.5 h組活力與對(duì)照組無顯著差異，但1 h組活力與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；解凍后，所有組精子活力都顯著低于冷凍前。對(duì)照組，0.5 h組和1 h組精子活力依次降低，但只有1 h組活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

3.2 質(zhì)膜完整率 冷凍前，0.5 h組與對(duì)照組無顯著差異，但1 h組活力與對(duì)照組相比有顯著下降（P＜0.05）；解凍后，同凍前相比所有組精子的質(zhì)膜完整率都顯著下降，但各組見無顯著差異（P＞0.05）。

3.3 頂體完整率 冷凍前各組間無顯著差異（P＞0.05），解凍后所有3組的頂體完整率都顯著下降，但各組間仍無顯著差異（P＞0.05）。

4 分析與討論

本研究調(diào)查了犬新鮮精液在常溫下的保存時(shí)間對(duì)冷凍效果的影響。犬新鮮精液在體外常溫條件下保存時(shí)間非常有限，因?yàn)榫褐械闹饕后w成分是前列腺液，其營(yíng)養(yǎng)、pH值等條件并不適合精液的長(zhǎng)期保存。England等證明，如果將犬精子與其自身的前列腺液混合培養(yǎng)，精子質(zhì)量會(huì)下降得更快[3]。Hermansson也發(fā)現(xiàn)，即使將新鮮精液置于4℃保存，精子活力在第1天就會(huì)顯著下降，到第2天精子活力全部喪失[4]。本研究的結(jié)果與前人的發(fā)現(xiàn)一致，常溫保存1 h就會(huì)使新鮮精液的活力和質(zhì)膜完整率出現(xiàn)顯著的下降。

由于不可避免的冷凍損傷，解凍后精液的各項(xiàng)指標(biāo)都顯著下降。對(duì)照組解凍后的活力（40.92%）還不是很理想，這可能與冷凍前精液活力（86.33%）不是非常高及冷凍過程中一些人為操作有關(guān)。對(duì)照組的活力顯著高于1 h組而與0.5 h組無顯著差異，這說明新鮮精液常溫保存0.5 h還不足以顯著影響解凍后精子活力，而保存1 h則會(huì)產(chǎn)生顯著的影響。考慮到冷凍前后對(duì)照組和0.5 h組的活力（凍前分別：86.33%和87.67%；凍后分別：40.92%和34.58%）差距有所增大，說明新鮮精液常溫保存0.5 h也對(duì)解凍后精液的品質(zhì)造成了一定的不利影響。解凍后質(zhì)膜和頂體完整率在各組間都無顯著影響，表明這兩個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)對(duì)試驗(yàn)中采用的常溫保存時(shí)間（0.5 h或1 h）沒有比活力指標(biāo)對(duì)保存時(shí)間那么敏感，推測(cè)更長(zhǎng)的保存時(shí)間才能造成顯著的形態(tài)學(xué)變化。

表2 犬新鮮精液常溫保存不同時(shí)間對(duì)冷凍前與解凍后的精子質(zhì)量的影響

犬精液冷凍的實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中，精液采集與冷凍實(shí)驗(yàn)室不在同一地情況時(shí)有發(fā)生。這種情況下，如果兩地距離間隔比較遠(yuǎn)，可以將鮮精用專門的稀釋液稀釋后冷藏保存，保存時(shí)間在2 d以內(nèi)不會(huì)影響冷凍效果[5]。本研究結(jié)果表明，如果兩地距離很近（半小時(shí)車程內(nèi)），就可以免去運(yùn)送犬只、配置稀釋液及冷藏操作等麻煩，可直接在室溫下將精液送至實(shí)驗(yàn)室冷凍，而不至于對(duì)冷凍效果產(chǎn)生顯著的不利影響。本研究選用的鮮精保存條件是便于實(shí)際操作的室溫（23℃），因?yàn)槿酉噍^于其他動(dòng)物的精子更能耐受低溫[6]，而精子在低溫時(shí)活動(dòng)代謝減緩，據(jù)此推斷在更低保存溫度下（如15℃或4℃等），精子質(zhì)量下降速度可能更慢，但尚需進(jìn)一步試驗(yàn)研究證實(shí)。

5 結(jié)語(yǔ)

犬新鮮精液在常溫下保存0.5 h不會(huì)對(duì)凍融精液的活力、質(zhì)膜和頂體完整率造成顯著影響；而保存1 h可顯著降低凍融精液的活力，但質(zhì)膜和頂體完整率不受影響。所以在犬精液冷凍的實(shí)際操作中，為了獲得最好的冷凍效果，精液采集后應(yīng)在30分鐘內(nèi)進(jìn)入冷凍程序。

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