免疫抑制劑FK506所致血糖升高副作用的機制研究*

張 玲， 孫 萌， 史 波， 唐麗麗， 吳存造， 蔡 勇， 夏 鵬， 鄭少玲， 楊亦榮， 陳必成

(溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325000)

移植術后糖尿病(post-transplantation diabetes mellitus，PTDM)是實體臟器移植后常見的并發癥之一，嚴重影響移植受者的長期生存率及移植臟器的存活率。據報道，PTDM的發病率因移植臟器的不同而有所差別，范圍波動在4%～50%[1]。大量研究表明[2]，免疫調節劑鈣調磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor, CaNI)的大量運用是PTDM的重要危險因素之一。臨床常用的CaNI以FK506和環孢霉素A(cyclosporin A, CsA)為主， 且FK506比CsA更易誘導PTDM[3]。目前，多數基礎研究主要關注FK506對胰島細胞的損傷及胰島素分泌的影響。也有研究表明[4-5]，使用CaNI的移植術后患者早期血胰島素水平普遍會高于正常組。FK506作為胰島移植術后最常用的免疫抑制劑之一,其誘導PTDM的機制存在矛盾之處。本研究通過建立動物模型，嘗試闡述FK506對大鼠脂肪因子分泌譜及其關鍵信號通路PPAR-γ的影響，以進一步揭示FK506誘導糖耐量損傷的機制。

材 料 和 方 法

1 材料及設備

FK506(國藥準字J20090142)購于安斯泰來制藥(中國)有限公司；生理鹽水購于上海麗臣生物科技有限公司；水合氯醛購于上海京索來寶生物科技有限公司；血糖儀及血糖試紙購于長沙三諾生物傳感股份有限公司；Trizol試劑購于Gibco；逆轉錄試劑盒和SYBR Green I熒光定量試劑盒購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；實時熒光定量PCR所用引物由上海生工生物技術有限公司合成(引物序列見表1)；PPAR-γ、adiponectin、GAPDH兔抗大鼠Ⅰ抗以及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG Ⅱ抗購于Abcam；所用熒光定量PCR儀ABI7500購于ABI。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 動物分組與模型制備

雄性SD大鼠12只，9周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號為SCXK(京)2012-0001，初始體重為(188.65±12.71)g，血糖(4.86±0.44)mmol/L。動物飼養環境：溫度(22±2) ℃，保持通風，自然晝夜節律變化，相對濕度40%～60%。給予動物標準飼料，1只1籠喂養。

大鼠適應性喂養1周后，隨機分為2組(每組6只)。給藥組大鼠給予腹腔注射1 mg·kg-1·d-1FK506 (1 mg溶于2 mL生理鹽水)；對照組大鼠給予腹腔注射1 mL·kg-1·d-1生理鹽水。在禁食不禁水8 h后，每天測空腹體重1次。用藥后，用大鼠固定器固定大鼠，斷尾取血，每2 d測空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)。

3 標本的留取與保存

給藥第15天，禁食8 h后，給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/kg)，固定，消毒。經下腔靜脈放血后，取大鼠腹腔內臟脂肪及附睪脂肪組織，以預冷生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水份后放入凍存管，迅速轉入液氮降溫，-80 ℃長期保存。

4 實時熒光定量PCR方法檢測靶基因表達情況

用 Trizol試劑盒提取給藥組和對照組大鼠脂肪組織的總RNA。參照逆轉錄試劑盒說明書，吸取2 μg RNA樣本在10 μL體系中進行逆轉錄反應。取逆轉錄產物1 μL進行PCR擴增, PCR擴增體系為：5 μL熒光定量染料2×SYBR熒光定量試劑、2 μL引物(上、下游各1 μL)、2 μL Plus反應液、1 μL cDNA。檢測靶基因包括: 氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPAR-γ)、脂聯素 (adiponectin)、抵抗素 (resistin)、瘦素 (leptin)、內酯素 (visfatin)、視黃醇結合蛋白4 (retinol-binding protein 4, RBP4)。擴增程序為：95 ℃ 3 min后，進行95 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40個循環擴增。得到的Ct值用2-ΔΔCt法計算mRNA表達的變化(結果為倍數關系)。

5 Western blotting法檢測靶蛋白表達情況

裂解液(RIPA)提取給藥組與對照組大鼠脂肪組織蛋白。凍融后的脂肪組織100 mg在冰上剪碎，加入1 mL 含1% PMSF的裂解液，作用60 min后吸取提取液； 12 000 r/min 離心30 min，取上清液測蛋白濃度；制備10%聚丙烯酰胺分離膠和5%濃縮膠，樣品5×SDS上樣緩沖液, 設置恒壓100 V, 電泳60 min；設置恒流350 mA，濕法電轉移(脂聯素30 min，PPAR-γ 55 min)， 轉膜后的PVDF膜經5% TBST脫脂奶粉室溫封閉2 h；然后加Ⅰ抗(稀釋在Ⅰ抗稀釋液中)，4 ℃孵育過夜，加入相應種屬Ⅱ抗，室溫孵育1.5 h，ECL發光液孵育膜5 min，暗室壓片曝光，顯影定影后膠片保存。

6 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示, 采用Microsoft Excel 2003統計軟件進行單因素方差分析和IBM SPSS Statistics 19統計軟件進行重復測量設計的方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 一般情況及大鼠體重的變化

在觀察時間內，大鼠活動正常，各組大鼠未出現死亡現象。2組大鼠在實驗過程中體重緩慢增加，第14天后2組大鼠體重無顯著差異(P>0.05)，見圖1。可排除體重對實驗結果的影響。

Figure 1. The changes of body weight in the rats fasted for 8 h.Mean±SD.n=6.

2 2組大鼠FBG變化

在實驗期間前10 d內，2組大鼠FBG值無明顯差異，見圖2。在第10天后，給藥組大鼠FBG趨勢發生變化，第12天的空腹血糖首次大于7 mmol/L。第13天、第15天連續監測FBG，給藥組大鼠持續≥7 mmol/L，而對照組大鼠血糖始終<6.5 mmol/L。給藥組大鼠FBG顯著高于對照組(P<0.05)。對照組大鼠FBG無顯著變化(P>0.05)。

3 2組大鼠脂肪組織PPAR-γ mRNA的表達

2組大鼠脂肪組織PPAR-γ mRNA的表達差異顯著(P<0.05)。給藥組大鼠PPAR-γ mRNA的表達量明顯低于對照組(P<0.05),見圖3。

Figure 2. The changes of fasting blood glucose in adult rats observed for 2 weeks.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs normal.

Figure 3. The mRNA expression of PPAR-γ in adipose tissues of the rats treated with FK506 or saline (normal).Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs normal.

4 2組大鼠脂肪因子mRNA表達的變化

與對照組相比，給藥組大鼠脂聯素的表達下降到20%，瘦素的表達下降到60%，差異顯著(P<0.05)；而內酯素、抵抗素及RBP4的表達相對升高，分別升高至對照組的3倍、2倍及1.6倍(P<0.05),見圖4。

5 2組大鼠脂肪組織PPAR-γ及脂聯素蛋白的表達變化

2組大鼠脂肪組織PPAR-γ及脂聯素蛋白表達差異顯著。與對照組相比，給藥組大鼠PPAR-γ蛋白的表達量下降到40%，脂聯素下降到19%(P<0.05),見圖5、6。

討 論

FK506是目前在臨床運用最為廣泛的CaNI免疫抑制劑，主要通過calcineurin/NFAT通路，抑制T細胞的免疫應答。目前，多數研究認為，PTDM發生機制主要是FK506在抑制免疫反應的同時，也通過calcineurin/NFAT通路作用于胰島β細胞，抑制胰島素的分泌[6]。也有體外研究表明，FK506可以作用于脂肪細胞，參與下調PPAR-γ的表達[7]。本研究表明，與對照組相比，給予FK506的大鼠FBG明顯升高；內臟脂肪組織的PPAR-γ、脂聯素及瘦素mRNA的表達量降低，內酯素、抵抗素及RBP4 mRNA的表達量升高。通過本實驗證實，FK506能夠調節脂肪組織中PPAR-γ及脂肪因子的表達。

Figure 4. The mRNA expression of adipocytokines in the rats fasted for 8 h and treated with FK506 or saline.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal.

Figure 5. The expression of PPAR-γ detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal.

Figure 6. The expression of adiponectin detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal.

早在2007年，Hernandez-Fisac等[8]用一定劑量的FK506成功建立PTDM大鼠模型，來研究FK506對胰島素基因表達的影響。本實驗以此為參考，在排除大鼠體重對實驗的干擾下，得到的FK506大鼠FBG明顯高于對照組。這充分說明，FK506是影響大鼠空腹血糖變化及胰島素對血糖變化調節能力的獨立因素。FK506對血糖的影響，不僅僅是因為抑制胰島素的分泌，也有可能是誘導了胰島素抵抗。有研究證實[5]胰島素抵抗存在于PTDM患者血糖升高之前，并貫穿全過程。所以，胰島素抵抗可能是PTDM的始發因素。因為，胰島素抵抗容易引起胰島素的積聚，高濃度的胰島素會降低胰腺β細胞對血糖的敏感性，引起血糖升高。而高血糖會抑制胰腺細胞的增殖，導致胰島素分泌不足，最終共同引起血糖的升高。所以，FK506可能首先影響的是胰島素對血糖的調節能力，最終導致血糖變化。

目前，PPAR-γ在脂肪組織的胰島素抵抗方面起到了重要作用。研究表明[9]，PPAR-γ主要與調節脂肪組織脂肪因子分泌有關。脂肪因子是脂肪組織分泌的一類細胞因子，可以直接作用于胰島素信號通路，調節血糖水平，可以改善胰島素抵抗。脂肪因子主要包括：脂聯素、瘦素、抵抗素、內酯素和RBP4等。其中，脂聯素具有增加脂肪酸氧化、提高葡萄糖攝取量、改善胰島素抵抗和抗炎的作用，具有胰島素增敏作用。人體實驗證明[10]脂聯素與機體胰島素敏感性之間有很強的相關性。瘦素可以抑制下丘腦的進食中樞，減少食物的攝取量，促進能量的消耗。但是，抵抗素、內酯素及RBP4可以抑制細胞對葡萄糖的攝取，誘導高血糖狀態及胰島素抵抗。從本實驗也可以看出，空腹血糖較高的 FK506處理大鼠，脂聯素及瘦素表達明顯降低，而抵抗素、內酯素及RBP4明顯升高。同時，又有研究表明PTDM患者血清脂聯素低于正常[11]，而高水平脂聯素對PTDM起到了很好的保護作用。所以，FK506對脂肪因子的調變作用可以影響血糖的變化。

目前，普遍認為脂肪因子的分泌主要與脂肪組織上的PPAR-γ通路有關。激活的PPAR-γ，與維甲酸類受體或糖皮質激素受體形成異二聚體，結合于特異性的DNA序列而使得靶基因激活，從而發揮轉錄調控脂肪因子分泌的作用。多數文獻報道，PPAR-γ激動劑促進脂聯素[12]及瘦素分泌[13]，抑制抵抗素及內酯素分泌，改善胰島素抵抗。本實驗也發現：FK506處理大鼠PPAR-γ表達量明顯降低，同時出現了脂聯素、瘦素的表達降低和內酯素、抵抗素的表達明顯升高，影響了正常的血糖調節機制,導致FBG明顯升高。可以看出，PPAR-γ與脂肪因子的表達有著明顯的一致性。FK506可以通過抑制PPAR-γ的表達，影響脂肪因子的分泌，誘導糖耐受損傷。

研究表明，leptin的表達與胰島素的抵抗呈正向關系[14]，高濃度的leptin可能會抑制脂肪細胞PPAR-γ的表達[15-16]。這可能是與島素的抵抗程度及研究的組織有關系，也說明PPAR-γ及leptin之間存在負反饋調節，具體機制有待進一步研究。

[參 考 文 獻]

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