應用微衛星PCR技術鑒別中國林蛙

蔡廣知，鄭 丹，張彥飛，貢濟宇

(長春中醫藥大學，長春 130117)

微衛星DNA指紋圖譜(microsatellite，MS)又稱為短串聯重復(short tandem repeats，STR)或簡單序列重復(simple sequnce repeat，SSR)，是基因組中一段由幾十個核苷酸組成的序列，此序列一般由幾個核苷酸(一般為2～4個)為單位多次串聯重復組成[1-2]。其中以雙核苷酸重復最為常見，真核生物的基因組中有大量的微衛星DNA存在,約每隔10～550 kb就存在一個微衛星。微衛星DNA由于具有特異性的PCR擴增、多態信息容量高、引物通用性好、突變率高、共顯性等特點[3-4]。本文采用微衛星鑒別技術，對長白山、黑龍江伊春、遼寧撫順、吉林四海林場4個地區的林蛙開展了鑒別研究。

1 材料

1.1 儀器 1110型PCR儀(美國Bio-Rad公司);TGL型臺式高速離心機(湖南星科科學儀器有限公司)；Dolphin-Doc凝膠成像分析儀(美國wealtec公司);JY-SP10水平電泳槽(杭州匯爾儀器公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；微型離心機(北京六一儀器有限公司)；PCF型超純水機(成都品成科技有限公司)。

1.2 試劑及耗材 DL500 Marker購自寶生物工程有限公司；熒光染料(EB)和單染料購于天根生化科技有限公司；50XTAE緩沖液和瓊脂糖均購自上海生工生物工程有限公司；PCR mix(英杰生命科技有限公司);DNA提取試劑盒編號SK-8222和動物組織快速直接PCR試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司。

2 方法

2.1 PCR的反應體系 PCR反應體系為25 μL:PCR反應液為12.5 μL(1 x),模板為0.5 μL(0.1～10 ng)，引物為上下游引物各1 μL(0.4 μmol/L)，超純水10 μL，PCR反應程序以正品長白山野生林蛙為模板。

2.2 PCR反應程序 95 ℃預變性5 min；95 ℃變性50 s；46～60 ℃退火50 s；72 ℃延伸90 s；共35個循環；最后72 ℃延伸5 min；8 ℃保存。

2.3 特異性鑒別引物的篩選 根據GenBank發表的中國林蛙的基因序列,以及國內……