Cry1Ba3蛋白對亞洲玉米螟殺蟲活性測定及其與BBMVs的結合分析

尹鳳翔，孫 凱，束長龍，宋福平，張 杰

(中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193)

Cry1Ba3蛋白對亞洲玉米螟殺蟲活性測定及其與BBMVs的結合分析

尹鳳翔，孫 凱，束長龍，宋福平，張 杰*

(中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193)

提取并純化Cry1Ba3蛋白截短片段，用飼喂人工飼料的方法對亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)初孵幼蟲進行生物活性測定。結果顯示，Cry1Ba3截短片段對亞洲玉米螟有良好的殺蟲活性(LC50=5.29 μg/g，95%置信限為3.96～7.10μg/g)。而純化的Cry1Ac蛋白60ku的活性片段對亞洲玉米螟初孵幼蟲的殺蟲活性LC50為0.83μg/g。提取亞洲玉米螟5齡幼蟲的BBMVs，用純化的Cry1Ba3和Cry1Ac蛋白進行競爭結合試驗，結果顯示Cry1Ba3與Cry1Ac在亞洲玉米螟中腸的結合沒有競爭作用，說明兩種毒素在亞洲玉米螟BBMVs上可能存在不同的受體。

Cry1Ba3蛋白； Cry1Ac蛋白； 亞洲玉米螟； 競爭結合

亞洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]主要為害玉米、高粱、谷子等作物，造成顆粒缺失甚至絕收。隨著轉基因技術的發展，目前國內外已經將包括cry1Ab、cry1Ac、cry1Ah、cry1Fa、cry1Ie等多種Bt殺蟲基因轉入玉米中[1-3]，對亞洲玉米螟和歐洲玉米螟[OstrinianubilalisHübner)]等鱗翅目害蟲具有良好的防治效果[4-5]。截至2012年底，全球轉基因玉米種植面積高達5 510萬hm2，充分顯示了巨大的經濟和社會價值[6]。然而，大面積種植轉Bt基因抗蟲作物不可避免地引發害蟲對其產生抗性[7-8]。與此同時，室內人工汰選結果顯示，亞洲玉米螟對Cry1Ac、Cry1Ab蛋白也會產生抗性[9]。因此，為延緩害蟲抗性的產生，發掘與已商業化應用的基因無交互抗性的新的Bt基因成為一項緊迫的任務。

cry1Ba3基因是由本實驗室克隆的殺蟲毒素基因，其編碼的Cry1Ba3蛋白對鱗翅目害蟲小菜蛾[Plutellaxylostella( Linnaeus)]、鞘翅目葉甲科害蟲馬鈴薯甲蟲[Leptinotarsadecemlineata(Say)]等均有良好毒殺活性，已用于工程菌構建[10]。目前已經確定Cry1Ba3對小菜蛾的最小活性區為第22位到第655位氨基酸[11]，蛋白結構域II上loop2(或者與loop1一起)對毒素蛋白的毒力影響較大，而loop3的改變對Cry1Ba蛋白的殺蟲活性沒有顯著影響[12]。進一步發現Cry1Ba3蛋白對Cry1Ac抗性小菜蛾有良好的殺蟲活性，說明這兩種毒素蛋白在小菜蛾上并無交互抗性[13]。

Bt Cry蛋白與昆蟲中腸刷狀緣膜囊泡(brush border membrane vesicles，簡稱BBMVs)上受體結合是發揮殺蟲作用的關鍵步驟[14]。近年來隨著Cry蛋白殺蟲機理研究不斷深入，來自昆蟲的新受體不斷被發現，糖基化磷脂酰肌醇(即GPI)錨定的氨肽酶N(APN)、糖基化磷脂酰基醇錨定的堿性磷酸酶(ALP)和類鈣黏蛋白(Cad)相繼被證實是Cry毒素在昆蟲體內主要的受體種類[15-17]。

在實驗室前期工作的基礎上，本研究測定了Cry1Ba3對亞洲玉米螟的殺蟲活性；比較了Cry1Ba3蛋白與Cry1Ac蛋白在亞洲玉米螟BBMVs上的競爭結合作用，為Cry1Ba3蛋白商業化應用和殺蟲機理研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

本研究中用到的菌株和質粒見表1。

表1菌株與質粒

Table1Strainsandplasmids

菌株和質粒Strainsandplasmids特征Characterization來源Source菌株StrainsEscherichiacoliBL21F-，ompT，hsdSB(r-Bm-B)，gal(λcⅠ857，ind1，Sam7，nin5，lacUV5-T7gene1)，dcm(DE3)本實驗室InthislabHD73B．thuringiensissubsp．kurstaki，carryingcry1Acgene本實驗室Inthislab質粒PlasmidspET?1Ba3?3HAmpR，7．3kb，containing1．9kbcry1Ba3gene本實驗室Inthislab

1.2 主要試劑和儀器

蛋白High range marker 購自賽默飛公司，鎳親和層析柱填料(chelating sepharose fast flow)購自GE公司，生物素(N-hydroxysuccinimidobiotin，NHS-Biotin)、堿性磷酸酶標記的親和素(avidin-alkaline phosphatase，AP-avidin)等購自Sigma公司，蛋白Prestained precision plus marker、蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad公司，堿性磷酸酶底物顯色試劑盒購自冰達公司。

Beckman高速離心機Avanti J-26xp；德國臺式Eppendorf 離心機5415C；美國Bio-Rad公司Mini protein Ⅲ蛋白電泳儀；美國GE公司高效液相色譜系統AKTA avant 25。

1.3 供試昆蟲

亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)初孵幼蟲和5齡幼蟲由北京綻諾斯特公司提供。

1.4 Cry1Ba3蛋白的表達與提取

將攜帶有cry1Ba3半長基因質粒pET-1Ba3-3H的大腸桿菌BL21接種于5 mL LB液體培養基[18]中，37 ℃、220r/min活化過夜；1%接種于300mL LB液體培養基中，37 ℃、220r/min培養至A600到0.5左右；加入IPTG至終濃度為1mmol/L，18 ℃、150r/min誘導16h。離心收集菌體，將菌體懸浮于20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液中。超聲破碎細胞10min(超聲功率：80%，超聲：5 s，暫停：5 s)，12 000r/min離心10min，收集上清，沉淀用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液懸浮；用SDS-PAGE電泳分析蛋白提取情況。

1.5 Cry1Ba3蛋白的親和層析純化

取1mL鎳親和層析柱填料裝入層析柱，用5倍柱體積的超純水清洗層析柱；加入1倍柱體積的0.1mol/L NiSO4，用移液器吸打混勻，室溫靜置10min，再用5倍柱體積的超純水洗柱子；加入5倍柱體積的平衡緩沖液(20mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.5 mol/L NaCl，20mmol/L咪唑)平衡柱子，將Cry1Ba3蛋白上清液上樣，接流穿的液體；待樣品上完后，用3×5倍柱體積的平衡緩沖液洗去雜蛋白；用1倍柱體積的洗脫緩沖液1(20mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.5 mol/L NaCl，200mmol/L咪唑)洗脫下目的蛋白并收集，重復4次；用5倍柱體積的洗脫緩沖液2(20mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.5 mol/L NaCl，1mol/L咪唑) 洗脫下雜蛋白；加入各種清洗緩沖液(2 mol/L NaCl，1mol/L NaOH，70%乙醇)進行清洗；加入再生緩沖液(0.5 mol/L NaCl，0.05 mol/L EDTA，0.5 mol/L NaCl)將層析柱再生；SDS-PAGE檢測洗脫下來的蛋白樣品。

1.6 Cry1Ba3蛋白的凝膠過濾純化

用AKTA avant蛋白液相分析系統對經過親和層析純化得到的Cry1Ba3溶液進行緩沖液置換，將目的蛋白溶液以2 mL/min的流速通過Hitrap 脫鹽層析柱，然后用磷酸緩沖液同樣以2 mL/min的流速進行洗脫，分體積接樣并SDS-PAGE檢測。挑選高純度的Cry1Ba3蛋白溶液通過Centriplus YM30濃縮管(MilliPore公司)進行濃縮。

1.7 Cry1Ac蛋白的提取、消化和純化

Cry1Ac蛋白的提取參見Xue等[19]的方法。將Cry1Ac蛋白與胰蛋白酶以質量單位比10∶1混合后，37 ℃溫育，設時間梯度(1、2、3、4、5 h)進行消化，SDS-PAGE檢測消化結果。消化后Cry1Ac蛋白的純化過程參見周子珊等[20]的方法。

1.8 亞洲玉米螟的生物活性測定

Cry1Ba3蛋白設置8個濃度，分別為：0.33、1.0、3.0、9.0、27.0、81.0和243.0μg/g；Cry1Ac蛋白設置8個濃度，分別為0.037、0.11、0.33、1.0、3.0、9.0和27.0μg/g。生物活性測定過程參考韓海亮等[9]的方法。7 d調查結果，用SPSS軟件對亞洲玉米螟生測結果統計分析。

1.9 Cry殺蟲蛋白的生物素標記

稱取2.2 mg Sulfo-NHS-SS-Biotin溶于360μL超純水中，配制成10mmol/L溶液，向待標記蛋白溶液中加入20倍摩爾量的生物素溶液，室溫靜置4 h，離心除去過量的生物素。Western blotting雜交檢測標記效果，并用堿性磷酸酶AP系統顯色，操作見試劑盒說明書。

1.10 亞洲玉米螟中腸BBMVs的提取及定量

亞洲玉米螟5齡幼蟲BBMVs的提取方法參考Wolfersberger方法[21]，然后用Bradford法(Bio-Rad試劑盒)對BBMVs進行總蛋白定量，操作見試劑盒說明書。

1.11 毒素蛋白與亞洲玉米螟BBMVs體外結合試驗

在BBMV中加入適量標記好的毒蛋白，用含0.1% BSA的PBS補足至100μL，室溫反應1h。18 000r/min離心10min后，用500μL含0.1% BSA的PBS緩沖液洗滌2次。加入10μL 1×SDS上樣緩沖液后煮沸5 min，12 000r/min離心5 min，吸取上清，進行SDS-PAGE。采用Bio-rad裝置，濕轉法轉移到PVDF膜上，膜在TBST中漂洗后置于封閉液中。緩慢搖動，室溫封閉1h。之后棄封閉液，加入用PBS稀釋的AP-Avidin，室溫輕搖1h。用TBST浸洗PVDF膜3次，每次15 min。最后用NBT/BCIP試劑顯色。競爭結合試驗與結合的步驟大致相同，只是在加入標記蛋白的同時加入不同種類的過量未標記的毒蛋白，同樣經過室溫溫育1h，最終通過Western blotting雜交檢測其對標記蛋白結合的影響。

2 結果與分析

2.1 Cry1Ba3蛋白提取與純化

用超聲破碎法從大腸桿菌BL21菌株中提取Cry1Ba3蛋白。經DNAMAN軟件分析可知，截短的Cry1Ba3蛋白分子量約為71ku。 經過鎳親和層析、透析并離心濃縮后最終得到Cry1Ba3蛋白的純化結果，見圖1。

圖1 SDS-PAGE分析純化的Cry1Ba3蛋白Fig.1 Analysis of purified Cry1Ba3protein by SDS-PAGE

2.2 Cry1Ac蛋白的提取、活化與純化

用等電點沉淀法從HD73菌株中提取Cry1Ac蛋白，表達出的Cry1Ac蛋白大小約為130ku，經胰蛋白酶消化1h后，形成約60ku的活性片段。然后將樣品通過AKTA avant蛋白液相分析系統進行陰離子交換層析、脫鹽柱層析并離心濃縮，最終得到純化的Cry1Ac蛋白(圖略)。

2.3 純化蛋白對亞洲玉米螟生物活性測定結果

經純化的Cry1Ba3半長蛋白對亞洲玉米螟的LC50=5.29 μg/g，95%置信限為3.96～7.10μg/g；Cry1Ac活化蛋白對亞洲玉米螟的LC50=0.83μg/g，95%置信限為0.66～1.07 μg/g。

2.4 亞洲玉米螟BBMVs的提取和定量

從約2 500頭亞洲玉米螟5齡幼蟲解剖獲得約10g中腸，分裝后凍存于-70℃冰箱。提取BBMVs經過SDS-PAGE分析，條帶清晰，分布均勻，能滿足競爭結合試驗要求(電泳圖略)。 Bradford法(Bio-Rad試劑盒)對BBMVs總蛋白定量，最終計算得BBMVs濃度為7.65 mg/mL。

2.5 結合試驗

首先用生物素標記的Cry1Ac蛋白與亞洲玉米螟的BBMVs進行體外飽和結合試驗，Western blotting檢測雜交結果見圖2。結果顯示Cry1Ac可以與亞洲玉米螟的BBMVs結合。終濃度為153μg/mL的亞洲玉米螟BBMVs與不同濃度的NHS-Biotin-Cry1Ac蛋白結合，發現從2.0μg/mL毒素蛋白濃度開始，隨著蛋白濃度的逐漸增加，毒素與BBMVs結合量逐漸增加。當NHS-Biotin-Cry1Ac蛋白濃度為32.0μg/mL時，與BBMV的結合量達到飽和。

圖2 BBMVs與NHS-Biotin-Cry1Ac結合的飽和度測定Fig.2 Determination of saturated binding between NHS-Biotin-Cry1Ac toxin and BBMVs

向亞洲玉米螟BBMVs與Cry1Ac蛋白飽和結合的反應體系中，分別加入5倍、10倍、100倍過量的未標記的Cry1Ba3蛋白，進行競爭結合試驗，用Western blotting檢測結果，見圖3。當加入不同量未標記的Cry1Ba3蛋白進行異源競爭時，經配體雜交熒光檢測顯示：標記的Cry1Ac蛋白條帶的亮度沒有發生變化，即說明對標記的Cry1Ac蛋白與亞洲玉米螟BBMVs的結合沒有影響(樣品2～4)，異源競爭沒有發生；而加入等量未標記的Cry1Ac蛋白進行同源競爭時，配體雜交熒光檢測顯示Cry1Ac蛋白條帶的亮度變暗(樣品1)，即說明標記的Cry1Ac蛋白與亞洲玉米螟BBMVs的結合作用減弱，發生了同源競爭作用。

同樣，用生物素標記的Cry1Ba3蛋白對亞洲玉米螟BBMVs進行飽和結合試驗，結果見圖4。終濃度為153μg/mL的亞洲玉米螟BBMVs與不同濃度的NHS-Biotin-Cry1Ba3蛋白結合，發現從0.5 μg/mL毒素蛋白濃度開始，隨著蛋白濃度的逐漸增加，毒素與BBMVs結合量逐漸增加。當Cry1Ba3蛋白濃度為8.0μg/mL時，與BBMVs的結合量達到飽和。

圖3 對Cry1Ac與BBMVs結合的同源及異源競爭Fig.3 Homologous and heterologous competition for NHS-Biotin-Cry1Ac binding to BBMVs

圖4 BBMVs與NHS-Biotin-Cry1Ba3結合的飽和度測定Fig.4 Determination of saturated binding between NHS-Biotin-Cry1Ba3toxin and BBMVs

向亞洲玉米螟BBMVs與標記Cry1Ba3蛋白飽和結合的反應體系中，分別加入100倍、300倍過量的未標記Cry1Ac蛋白和10倍、100倍未標記的Cry1Ba3蛋白，進行競爭結合試驗，Western blotting檢測結果見圖5。當加入不同量未標記的Cry1Ac蛋白進行異源競爭時，經配體雜交熒光檢測顯示標記的Cry1Ba3蛋白條帶的亮度沒有發生變化，即說明未發生異源競爭作用(樣品2和3)，而加入10倍濃度未標記的Cry1Ba3蛋白進行同源競爭時，標記的 Cry1Ba3蛋白僅有很弱的條帶(樣品4)，加入100倍濃度未標記的Cry1Ba3時標記蛋白與BBMVs的結合被完全競爭(樣品5)，發生了同源競爭作用。

圖5 對Cry1Ba3與BBMVs結合的同源及異源競爭Fig.5 Homologous and heterologous competition for NHS-Biotin-Cry1Ba3binding to BBMVs

3 討論

本研究提取并純化了Cry1Ba3蛋白，對亞洲玉米螟進行生物活性測定，結果顯示截短的Cry1Ba3蛋白對亞洲玉米螟具有良好的殺蟲活性，高于Cry1Ba3全長蛋白(數據未顯示)。本研究中使用的Cry1Ba3蛋白是Cry1Ba3的71ku的N端活性區，包括第22位至655位氨基酸，昆蟲攝入體內以后可能會進一步消化成為真正的活性片段。

本研究證明Cry1Ba3與Cry1Ac蛋白在亞洲玉米螟的BBMVs上沒有競爭作用，表明兩種毒素蛋白在亞洲玉米螟BBMV上可能存在不同的受體。毒素與受體的結合在其發揮殺蟲活性的過程中有關鍵的作用，也是昆蟲產生抗性的重要環節[22]。Sek Yee Tan等通過比較Cry1Ab和Cry1Fa與亞洲玉米螟和歐洲玉米螟BBMV的結合作用，發現Cry1Ab或Cry1Fa分別在這兩類玉米螟體內有相似的受體，而在亞洲玉米螟或者歐洲玉米螟體內這兩種Cry蛋白各自的高親和力受體并不相同，這也支持了之前報道的Cry1Ab和Cry1Fa在玉米螟上表現出低交互抗性的現象[23]。已經證明Cry1Ba3對Cry1Ac抗性小菜蛾有很好的殺蟲活性，為了探究Cry1Ba3與Cry1Ac在亞洲玉米螟上是否存在交互抗性，接下來需要將Cry1Ba3對亞洲玉米螟的抗性品系進行生物活性測定。Cry1Ba3全長蛋白和Cry1Ac全長蛋白的氨基酸序列相似性為57%，結構域Ⅱ區域的相似性為28%。大量的研究證明結構域Ⅱ決定Cry毒素蛋白與昆蟲受體的特異性結合[24]。所以今后可以選擇結構域Ⅱ氨基酸序列相似性低的Cry毒素蛋白基因的組合作為綜合防治蟲害和研發轉基因植物時的備選基因，有利于規避昆蟲對Cry毒素蛋白產生交互抗性的風險。

Cry1Ba3和Cry1Ac蛋白的純化是本試驗的關鍵。提取的Cry1Ba3半長片段經過鎳親和層析純化后溶液中咪唑濃度很高，影響后續生物素標記試驗和競爭結合試驗的效果，需要通過透析的方法除去。用胰蛋白酶對Cry1Ac蛋白消化以后，溶液中有大量酶解下的小肽段，也會影響后續試驗，所以需要對Cry1Ac進行緩沖液置換。為得到純度較高的樣品，在用AKTA avant蛋白液相分析系統進行純化時，色譜圖出峰后要小體積收集樣品，避免交叉污染。

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AnalysisofinsecticidalactivityofCry1Ba3proteinagainstOstriniafurnacalisandbindingassaywithBBMVs

Yin Fengxiang, Sun Kai, Shu Changlong, Song Fuping, Zhang Jie

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Truncated fragment of Cry1Ba3protein was extracted and purified.Bioassay against neonates ofOstriniafurnacaliswas conducted by feeding artificial diet with the truncated fragment of Cry1Ba3.The result showed truncated fragment of Cry1Ba3had a high toxicity againstO.furnacalis(LC50=5.29 μg/g，95% fiducial limit was between 3.96and 7.10μg/g).LC50of purified active fragment of Cry1Ac protein,with molecular weight of 60ku,was 0.83μg/g against neonates ofO.furnacalis.Then the BBMVs of the fifth instar larvae ofO.furnacaliswas extracted.Competitive binding experiment was conducted by using purified Cry1Ba3and Cry1Ac protein.The result showed Cry1Ba3and Cry1Ac had no competitive action in the process of binding to midgut ofO.furnacalis,indicating these two toxins may have different receptors on BBMVs ofO.furnacalis.

Cry1Ba3protein; Cry1Ac protein;Ostriniafurnacalis; competitive binding

2013-06-08

：2013-10-20

國家“973”計劃項目(2009CB118902)；國家自然科學基金項目(31272115)

S 476.12

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.005

* 通信作者 Tel: 010-62815921； E-mail: jzhang@ippcaas.cn