油茶炭疽病拮抗細菌Y13主要抑菌物質分離純化及作用方式

孟慶敏，周國英，劉君昂，左 杰，董文統，王瑞芹

(中南林業科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004)

油茶炭疽病拮抗細菌Y13主要抑菌物質分離純化及作用方式

孟慶敏，周國英，劉君昂*，左 杰，董文統，王瑞芹

(中南林業科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004)

油茶內生拮抗細菌Y13是一株對油茶炭疽病菌有較強抑制作用的枯草芽胞桿菌。為了確定其抑菌物質的成分組成及其對油茶炭疽病菌的作用方式，本文通過乙醇沉淀、固相萃取、反相高效液相色譜法及LC-MS對抑菌物質進行分離鑒定。一共分離純化出16個活性組分，保留時間在10.5～26.0min的8個組分對于油茶炭疽病菌產生明顯的抑菌圈，其中保留時間為11.0min處的色譜峰抑菌效果最強，經質譜初步鑒定確定該化合物的分子量為1042.56u；保留時間在27.5～39.5 min的8個組分導致油茶炭疽病病原菌菌絲顏色加深，其中以保留時間37.5 min處的色譜峰效果最為明顯，質譜鑒定該化合物的分子量為1480.85 u。顯微觀察發現它們通過導致菌絲斷裂、畸形、原生質凝集的方式抑制菌絲生長；通過使孢子畸形、膨大、消融而抑制孢子萌發。

油茶炭疽病； 拮抗細菌； 抑菌物質； 分離純化； 作用方式

油茶是中國特有木本油料植物，油茶茶籽及其副產品經濟價值極高[1]，但近幾年來隨著油茶產業的發展，油茶病蟲害日趨嚴重，特別是油茶炭疽病嚴重影響了油茶的產量和品質。油茶炭疽病引起的油茶落果率通常在20%～40%，嚴重時達60%以上[2-3]。由于化學農藥的大量使用，不僅嚴重污染了環境，同時也使油茶植株產生了抗藥性，因此油茶病蟲害的生物防治已成為當前亟待解決的重大問題。

本研究前期已從健康油茶葉片中篩選出對油茶炭疽病有強烈抑制作用的油茶內生細菌Y13，經生理生化分析及16S rDNA鑒定油茶內生菌Y13為枯草芽胞桿菌[4]。對于枯草芽胞桿菌所產生的抑菌物質目前已經有了大量研究。枯草芽胞桿菌可以產生多種抑菌物質，其中主要包括兩大類：一類是由核糖體途徑合成的肽類抗生素如枯草菌素(subtilosin)[5]、酶類[6]和少量的抗菌蛋白等[7]，另一類是由非核糖體途徑合成的脂肽類抗生素如表面活性素(surfactin)[8]、伊枯草菌素(iturin)[9]和豐產素(fengycin)[10]等。枯草芽胞桿菌抑菌物質主要是通過溶解病原真菌的細胞壁，從而使原生質泄露，菌絲斷裂等[11]。為了明確油茶內生細菌Y13所產生的抑菌物質的成分及結構，本研究首先對油茶內生菌Y13產生的抑菌物質進行了分離純化，為之后的質譜結構鑒定奠定良好的基礎。同時本研究也對抑菌物質對病原菌菌絲和孢子的影響做了顯微觀察，為以后抑菌機理的深入研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1.1.1 拮抗細菌

枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)Y13為中南林業科技大學經濟林培育與保護教育部重點實驗室森林微生物菌種保藏室分離保存。

1.1.2 指示病原菌

油茶炭疽病病原菌(Colletotrichumgloeosporioides)為中南林業科技大學經濟林培育與保護教育部重點實驗室森林微生物菌種保藏室分離保存。

1.1.3 Y13發酵培養基

葡萄糖1.5%，酵母膏1.0%，牛肉膏0.3%，氯化鈉1.5%，蒸餾水1000mL，pH7.0。NB培養基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5%，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4。

1.2 Y13發酵液抑菌物質分離

1.2.1 油茶內生菌Y13發酵液制備

從斜面培養基中挑取一環Y13菌體接入NB液體培養基中，30℃，140r/min搖床振蕩培養72 h，配制成Y13發酵液。4 ℃，15 000r/min，離心30min，去掉沉淀，用0.22 μm的濾膜過濾發酵上清液，得到無菌濾液，即為抑菌物質粗提物。

1.2.2 乙醇沉淀法分離抑菌物質

向無菌濾液中加入無水乙醇至濃度依次為40%、60%、70%、80%、90%，4 ℃靜置4 h，然后4 ℃，20000r/min，離心30min，保留上清液。對上清液進行旋轉蒸發濃縮除去乙醇，4 ℃保存備用。

1.2.3 濾紙片法對各濃度提取物作抑菌活性檢測

取油茶炭疽病病原菌餅接入PDA液體培養基中，30℃，160r/min，恒溫振蕩96h，制成油茶炭疽病病原菌發酵液，從中吸取300μL于PDA固體培養基中，涂布均勻。用100μL無菌水溶解提取物，吸取各個濃度的乙醇提取物20μL分別滴在濾紙片上，以無菌發酵上清液為對照，28 ℃下恒溫培養48 h，測量抑菌圈直徑。每個試驗重復4次。

1.3 Y13抑菌物質純化

1.3.1 固相萃取法純化Y13抑菌物質

利用C18固相萃取柱對80%乙醇提取物進行固相萃取分離，先收集不被吸附的組分，再分別以45%甲醇、65%甲醇、95%甲醇作為萃取劑，分別收集每個濃度萃取劑所洗脫下來的組分，旋轉蒸發去除組分中的甲醇，以無菌發酵上清液為對照，通過濾紙片擴散法進行抑菌活性檢測，每個處理3個重復。將活性最強的組分干燥濃縮，4 ℃保存備用。

1.3.2 HPLC純化Y13抑菌物質

將活性最強的組分先用20%甲醇溶解，再用0.45 μm的有機系濾膜過濾，通過制備型C18(4.6mm×250mm，5 μm)色譜柱進行純化。流動相為含0.1%三氟乙酸的甲醇(A)和超純水(B)。用43%～95%甲醇進行梯度變速洗脫，進樣量為30μL，檢測波長為210nm。收集每個色譜峰組分，將各收集液干燥濃縮，4 ℃備用。

1.3.3 HPLC純化后各組分抑菌活性檢測

將初步純化后的所有活性組分所對應的色譜峰做積分處理，分別用20%甲醇溶解所有樣品，最終使各組分的濃度一致。以20%甲醇為對照，每個組分吸取20μL進行抑菌活性檢測并測量抑菌圈直徑。每個處理重復3次。

1.3.4 HPLC參數優化

用0.45 μm的有機系濾膜過濾活性組分，改用流動相A為乙腈，流動相B為超純水，流動相A和B中均加有0.1%的三氟乙酸，流速為0.7 mL/min，檢測波長為214 nm，梯度洗脫。

1.4 Y13抑菌物質對油茶炭疽病菌的作用方式

1.4.1 抑菌物質對油茶炭疽病菌菌絲形態的影響

分別選取抑菌圈最大的一個組分和變色圈最大的一個組分，用接種環挑取它們與炭疽病菌菌塊交界處的菌絲于顯微鏡下觀察。以正常生長的菌絲作為對照。

1.4.2 抑菌物質對油茶炭疽病菌孢子萌發的影響

采用載玻片懸滴培養法，取正常的油茶炭疽病菌孢子于載玻片上，向其中分別滴加已用無菌水溶解后的抑菌圈最大的組分和變色圈最大的組分，以滴加無菌水的孢子作為對照，室溫放置24 h后于顯微鏡下觀察。

1.5 Y13主要抑菌物質結構鑒定

采用美國熱電LTQ velos pro型液相色譜-質譜聯用儀對Y13產生的主要抑菌物質進行質譜鑒定。

1.6 數據統計分析

試驗數據用平均值±標準差來表示。采用 SAS 8.0軟件對試驗數據進行方差分析和多重比較。當P<0.05 時，表示差異顯著；當P>0.05 時，表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 Y13發酵液抑菌物質分離

抑菌結果表明，各濃度乙醇提取物均有抑菌效果。方差分析表明，乙醇濃度對抑菌物質抑菌活性的影響達到顯著性差異(P<0.05)，說明乙醇濃度的高低直接影響了抑菌物質活性的強弱。

對乙醇提取物抑菌活性進行差異性分析，見表1。從中可以看出80%乙醇提取物的抑菌效果最強，明顯高于其他濃度提取物的抑菌活性。通過LSD法進行多重比較分析，結果發現80%乙醇提取物的抑菌圈直徑最大，活性最強，與其他所有處理組的抑菌活性均有顯著性差異，說明此抑菌物質最易被80%乙醇提取出來，因此將80%作為乙醇的最佳提取濃度。

表1乙醇提取物抑菌活性的差異性分析1)

Table1Differenceanalysisofinhibitoryeffectofantimicrobialsubstancespurifiedbyethanolprecipitation

乙醇濃度/%Theconcentrationofethanol抑菌圈直徑/mmThediameterofinhibitionzone40(14．50±1．05)cd60(16．50±1．05)bc70(15．50±1．98)c80(19．50±1．05)a90(12．67±0．52)dCK(17．33±2．25)b

1)采用LSD法進行多重比較分析，同列數值后具有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。表中數據用平均值±標準差表示。 Values in each column followed by different letters are significantly different at 5% level by Duncan’s mean value test.The data are shown as Mean±SD.

2.2 Y13抑菌物質純化

2.2.1 固相萃取法純化抑菌物質

抑菌結果表明，只有不被吸附在固相萃取柱上的組分沒有抑菌活性，其他組分均有明顯抑菌效果，其中65%甲醇洗脫組分的抑菌效果最強(見表2)。65%甲醇洗脫組分與其他組分的活性均有顯著性差異。

表2固相萃取抑菌物質的抑菌活性1)

Table2Theinhibitoryactivityofantimicrobialsubstancepurifiedbysolid-phaseextraction

甲醇濃度/%Theconcentrationofmethanol抑菌圈直徑/mmThediameterofinhibitionzone0―45(20．17±0．75)b65(29．50±3．21)a95(18．33±1．75)bCK(20．17±0．75)b

1)采用LSD法進行多重比較分析，同列數值后字母不相同表示差異顯著(P<0.05)。表中數據用平均值±標準差表示。 Values in each column followed by different letters are significantly different at 5% level by Duncan’s mean value test.The data are shown as Mean±SD.

2.2.2 高效液相色譜法純化抑菌物質

經過43%～95%乙腈進行梯度洗脫后得到20個主要的色譜峰，見圖1。

2.2.3 HPLC純化后各組分抑菌檢測結果

20個主要色譜峰抑菌結果如圖2所示。主要可以分為兩大類，其中前8個洗脫峰組分是一類抑菌物質，它們主要產生明顯的抑菌圈。9號到16號組分可以產生明顯的變色圈，使指示菌菌絲的顏色明顯加深，變黑。而17～20號無任何抑菌效果。

對各個組分產生的抑菌圈直徑和變色圈直徑進行測量，結果如圖3所示，在產生明顯抑菌圈的前8個組分中，1號的抑菌活性最強，其次為3號組分，5號組分最弱，72 h后5號組分幾乎完全失活，分析原因可能是由于濃度較低導致。在9～16號組分中，14號組分所產生的變色圈最大，其導致菌絲顏色加深的效果最為明顯。

2.2.4 HPLC參數優化結果

通過一系列的色譜條件優化后，使保留時間在29.5～35.0min期間的色譜峰達到一定的分離效果，符合質譜鑒定的要求，結果見圖4。

2.3 Y13主要抑菌物質結構初步鑒定

利用ITMS對保留時間為11.0min和37.5 min的兩個化合物分別做質譜解析，結果見圖5和圖6。圖5中檢測到[M+H ]+的m/z為1043.56，因此確定該物質的分子量為1042.56u。圖6中檢測到[M+H ]+的m/z為1481.85，因此確定此物質的分子量是1480.85 u，查閱文獻分析對比，確定前者為iturin同系物，后者為fengycin同系物。

圖1 反相HPLC純化抑菌物質Fig.1 Purification of antimicrobial substance by RP-HPLC

圖2 各組分對油茶炭疽病菌的作用效果Fig.2 The inhibitory effect of the peak fractions on Colletotrichum gloeosporioides

圖3 抑菌物質對油茶炭疽病菌的抑制作用Fig.3 The inhibitory effect of antimicrobial substance on C.gloeosporioides

圖4 優化后高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram after optimization

圖5 保留時間為11.0min處化合物的一級質譜圖Fig.5 The mass spectrum at retention time 11.0min

圖6 保留時間為37.5 min處化合物的一級質譜圖Fig.6 The mass spectrum at retention time 37.5 min

2.4 Y13抑菌物質對油茶炭疽病菌的作用方式

2.4.1 抑菌物質對油茶炭疽病菌菌絲形態的影響

顯微鏡下觀察油茶炭疽病菌經兩類主要抑菌物質處理前后，菌絲形態的變化見圖7。結果發現，油茶炭疽病菌的正常菌絲形狀較規則，細長，原生質分布均勻。而經1號抑菌物質處理后菌絲形狀發生扭曲，菌絲多處發生了斷裂及纏繞。而14號抑菌物質導致菌絲扭曲變形且菌絲節間變粗。因此這兩類抑菌物質均抑制菌絲的生長。

圖7 抑菌物質處理油茶炭疽病菌菌絲形態的顯微觀察Fig.7 Microscope observation of the mycelial morphology of C.gloeosporioides treated with antimicrobial substance

2.4.2 抑菌物質對油茶炭疽病菌孢子的影響

顯微鏡下觀察油茶炭疽病菌孢子見圖8。正常孢子的形狀很規則，呈扁平狀，長而細。經1號抑菌組分處理后的大多數孢子破裂，形狀不規則且混成一片。14號抑菌組分處理后的孢子明顯變得短小而粗大，其破壞程度相對于1號處理組較輕，但仍抑制了孢子的萌發。因此兩類抑菌物質均可以導致孢子破碎，抑制其萌發。

圖8 抑菌物質處理油茶炭疽病菌孢子形態的顯微觀察Fig.8 Microscope observation of C.gloeosporioides spores treated with antimicrobial substance

3 結論與討論

目前對于枯草芽胞桿菌抑菌物質的研究已有相關報道。枯草芽胞桿菌產生的抑菌物質主要為脂肽類抗生素、細菌素及少量的抗菌蛋白[5，12-15]。裴韜等[16]利用鹽析、透析以及離子交換層析相結合的方法對枯草芽孢桿菌P72進行分離純化，最終得到對小麥赤霉病菌有很強抑制能力的抗菌蛋白。沈錦玉等[17]通過濃鹽酸沉淀、乙醇抽提、離子交換層析和高效液相色譜法對枯草芽胞桿菌B115進行分離純化，最終得到分子量為803.6Da的抑菌物質。

本試驗主要采用乙醇沉淀、SPE固相萃取以及反相高效液相法得到Y13代謝物中的抑菌物質。經離子阱質譜初步檢測，確定保留時間在11.0min和37.5 min處的化合物的主要離子峰的質荷比分別為1043.56和1481.85。Chen等[18]從枯草芽胞桿菌JA中分離純化出主要的活性物質，并通過ESI-MS分析鑒定出質荷比為1043.4的物質為iturin同系物。因此確定本試驗中質荷比為1043.56的物質為iturin同系物。楊琦瑤等[19]從對辣椒疫霉病菌有強烈抑制作用的枯草芽胞桿菌菌株B006的發酵液中提取出主要成分，經質譜鑒定質荷比為1436、1450、1478和1492的物質為fengycin同系物，而本研究中質荷比為1481.85的物質與報道中物質相差不多，推斷應為相差若干個亞甲基的fengycin同系物。具體同系物結構目前正在解析當中，有望發現新的同系物結構。

通過顯微觀察確定抑菌物質作用方式。對抑菌物質處理后的菌絲和孢子進行鏡檢，結果表明這些抑菌物質可以溶解油茶炭疽病菌的細胞壁從而使原生質外漏，導致菌絲斷裂，同時還可以抑制孢子的萌發。這些抑菌物質對油茶炭疽病菌的抑制效果較好，是一類有開發價值的抗真菌藥物。對于油茶內生菌Y13所產抑菌物質目前未見報道，本試驗共純化出16個抑菌組分，為了進一步確定這些物質的結構成分，目前正在進行質譜解析，希望通過了解抑菌物質的具體結構，為今后從代謝調控方面深入研究其抑菌機理提供有力支持。

[1] 靳愛仙,周國英,李河.油茶炭疽病的研究現狀、問題與方向[J].中國森林病蟲,2009,28(2): 27-31.

[2] 羅萬周,羅萬業.油茶炭疽病及其防治方法[J].農技服務,2007,24(6): 70.

[3] 季冬明.油茶無公害栽培的有害生物防治技術[J].安徽農學通報,2006,12(5): 204.

[4] 布婷婷,周國英,劉君昂,等.油茶內生拮抗細菌Y13菌株16S rDNA序列分析及抑菌機理研究[J].經濟林研究,2012,30(3)：10-15.

[5] 劉永鋒.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Bs-916胞外抗菌蛋白質的純化及其鑒定[D].南京：南京農業大學,2006.

[6] Chang W T,Chen M L,Wang S L.An antifungal chitinase produced byBacillussubtilisusing chitin waste as a carbon source[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology 2010,26(5): 945-950.

[7] Stover A G,Driks A.Secretion,localization,and antibacterial activity of Tas A,aBacillussubtilispore associated protein[J].Journal of Bacteriology,1999,181(5): 1664-1672.

[8] Peypoux F,Bonmati J M,Wallach J.Recent trends in the biochemistry of surfactin[J].Applied Microbiology Biotechnology,1999,51(5): 553-563.

[9] Maget D R,Peypoux F.Iturins,a special class of pore forming lipopeptides: biological and physicochemical properties[J].Toxicology,1994,87(1): 151-174.

[10]Ongena M,Jacques P,Toure Y.Involvement of fengycin type lipopeptides in the multifaceted biocontrol potential ofBacillussubtilis[J].Applied Microbiology Biotechnology,2005,69(1): 29-38.

[11]Babasaki K,Takao T,Shimonishi Y.Subtilosin A,a new antibiotic peptide produced byBacillussubtilisis 168: isolation,structural analysis,and biogenesis[J].Journal of Biological Chemistry,1985,98(3): 585-603.

[12]趙秀香,趙柏霞,馬鏑等,枯草芽孢桿菌SN-02抑菌物質的分離、純化及結構測定[J].植物保護學報，2008,35(4):323-326.

[13]葉云峰,黎起秦.枯草芽孢桿菌B47菌株抗菌物質的分離純化及其對玉米小斑病的防治作用[J].中國生物防治學報，2011,27(3): 357-361.

[14]劉靜,王軍,姚建銘，等.枯草芽孢桿菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分離純化[J].微生物學報，2004,44(4): 511-514.

[15]南楠,戚向陽,袁勇軍.枯草芽孢桿菌WL17產抗菌物質的分離、分析及其抗菌特性研究[J].中國食品學報,2012,12(8): 17-23.

[16]裴韜,任大明,石皎.小麥赤霉病拮抗菌P72抗菌物質的分離純化和性質研究[J].安徽農業科學，2009，37(6): 2576-2577.

[17]沈錦玉,尹文林,曹錚,等.枯草芽孢桿菌B115抗菌蛋白的分離純化及部分性質[J].水生生物學報,2005,29(6): 689-693.

[18]Chen H,Wang L， Su C X.Isolation and characterization of lipopeptide antibiotics produced byBacillussubtilis[J].Letters in Applied Microbiology,2008,47:180-186.

[19]楊琦瑤，索雅麗，郭榮君，等.枯草芽孢桿菌B006對黃瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌組分分析[J].中國生物防治學報,2012,28(2):235-242.

IsolationandpurificationofantimicrobialsubstanceproducedbyendophyticbacteriaY13intheCamelliaanditsinhibitoryeffectonCamelliaanthracnose

Meng Qingmin，Zhou Guoying，Liu Jun’ang，Zuo Jie，Dong Wentong，Wang Ruiqin

(KeyLaboratoryoftheMinistryofEducationforNon-timberProductForestSilvicultureandProtection，CentralSouthUniversityofForestry﹠Technology，Changsha410004，China)

Bacillussubtilisstrain Y13isolated fromCamelliahas strong inhibitory activity againstColletotrichumgloeosporioides.In order to identify the antimicrobial compounds and the inhibition mechanism againstC.gloeosporioides,the antimicrobial substances were isolated and purified by ethanol precipitation,solid phase extraction and reversed phase high performance liquid chromatography.Antifungal activity assay indicated that 16main peak fractions had inhibition activity.The 16main peak fractions can be divided in two groups.One group at retention time from 10.5 min to 26.0min showed inhibition activity.The peak fraction at retention time 11.0min showed the strongest activity and the molecular weight was 1042.56u identified by LC-MS.The other group at retention time from 27.5 min to 39.5 min dark the mycelia ofC.gloeosporioides.The compound at retention time 37.5 min showed the strongest activity and the molecular weight was 1480.85 u.Microscope observation revealed that the 2 compounds could break up and enlarge the mycelia,deform and swell the spores,and inhibit the spore germination.

Camelliaanthracnose; antagonistic bacteria; antimicrobial substance; isolation and purification; inhibition mechanism

2013-09-22

：2013-12-02

國家自然科學基金項目(31170598)；湖南省研究生科研創新項目(CX2013B356)；中南林業科技大學研究生科技創新資助項目(CX2013B25)

S 435.65， S 476.8

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.007

* 通信作者 Tel: 0731-85623131； E-mail: kjc9620@163.com