豇豆輪紋病病菌產毒條件篩選及毒素活性測定

劉志恒，李健冰，安 心，李 蔚，曹友文，王君赫

(1.沈陽農業大學植物保護學院，沈陽 110866； 2.彰武縣植保站，阜新 123200)

豇豆輪紋病病菌產毒條件篩選及毒素活性測定

劉志恒1*，李健冰1，安 心1，李 蔚1，曹友文2，王君赫1

(1.沈陽農業大學植物保護學院，沈陽 110866； 2.彰武縣植保站，阜新 123200)

采用種子萌發抑制率和種子胚芽抑制率的檢測方法，研究了豇豆輪紋病病原菌(Corynesporacassiicola)在不同培養基、培養時間、培養溫度、培養液pH、光照和振蕩條件下粗毒素的產生及其活性。試驗結果表明：不同的培養條件下病原菌產生毒素活性不同，查彼培養液為最佳培養液，振蕩培養可以促進毒素的產生，最適的產毒pH為7～8，最適溫度為20～25 ℃，最佳培養時間為15 d，光照條件下病原菌粗毒素的活性最大。豇豆輪紋病粗毒素對于不同寄主的活性測定結果表明：豇豆輪紋病菌毒素接種的10種供試植物中，大豆、菜豆致病反應明顯，相對的病斑較大，而對黃瓜無致病力，不產生病斑。

豇豆輪紋病； 多主棒孢菌； 毒素； 活性

豇豆作為遼寧的主要蔬菜作物之一，隨著栽培面積的擴大和栽培年限的增加，病害的種類和病原菌的種群結構發生了很大變化，出現了一些新病害。2011年8月作者在遼寧省新民市調查中發現一種新病害，該病害主要危害豇豆葉片，嚴重時也危害豆莢，病害蔓延迅速并且危害嚴重，在7-8月危害最重，病葉率達到60%以上，給豇豆生產造成了很大損失。作者通過病害癥狀描述、病原菌形態鑒定及分子序列比對，并經柯赫氏法則證病，證明豇豆上新見病害——輪紋病的病原菌為真菌多主棒孢(Corynesporacassiicola)。

長期以來，種植抗病品種和施用化學農藥在防治真菌病害中發揮了巨大作用，但由于多數病原真菌容易發生遺傳變異，因此，出現抗性菌株的現象經常發生，并且高劑量的施用化學農藥勢必會影響環境及食品的安全性。病菌致病粗毒素在適當的選擇劑量下可用于篩選高抗病水平的突變體[1]，病原菌的產毒能力與培養基類型和環境條件密切相關[2]。為了明確毒素在病程中的作用和應用粗毒素進行細胞突變體篩選，首先需要培養出大量的病菌粗毒素。然而對于豇豆輪紋病病原菌的毒素培養條件迄今未見報道。

本研究在分離豇豆輪紋病的基礎上，初步探討了豇豆輪紋病菌的產毒培養條件,以期為豇豆輪紋病的相關研究提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試作物選用9種：豇豆、菜豆、大豆、花生、茄子、辣椒、絲瓜、黃瓜和西葫蘆。采用市售幼苗用于試驗。

1.2 病原菌分離及毒素的提取

2011-2012年，于遼寧省新民市露地栽培豇豆采集具有典型特征的輪紋病葉片，采用常規組織分離方法[3]進行病原菌分離和純化，并經單孢分離獲得病菌純培養備用。

采用常規方法培養獲取病菌毒素。將供試菌株于PDA平板培養基恒溫培養，用打孔器打取約0.5 cm的菌餅4塊，置于下述供試液體培養基內培養。將不同條件培養獲得的病菌培養液用8層無菌紗布過濾，然后濾液用濾紙抽濾，得到無菌濾液。將無菌濾液經8 000r/min離心10min，取得上清液即為病原菌粗毒素[4]。將所得的粗毒素接種于供試豇豆種子上，置于25 ℃黑暗條件培養36h，計測種子萌發率及胚芽長度。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌粗毒素產生條件的篩選

培養液的篩選。試驗選用以下5種培養基，調節pH均為7。

(1)PD培養液：馬鈴薯200g，葡萄糖12 g，蒸餾水1000mL。

(2)PS培養液：馬鈴薯200g，蔗糖12 g，蒸餾水1000mL。

(3)Fries培養液：酒石酸銨5 g，KH2PO41.0g，NH4NO31.0g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.1g，CaCl20.1g，酵母浸膏 1.0g，蔗糖30g，蒸餾水1000mL。

(4)Czapek培養液：NaNO32 g，K2HPO41g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.01g，蔗糖 30g，蒸餾水 1000mL。

(5)Richard培養液：KNO310g，KH2PO45 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，FeCl30.02 g，蔗糖 50g，蒸餾水1000mL。

培養時間篩選。設置3、6、9、12、15、18、21、24 d計8個處理時間。將直徑0.5 cm菌餅移入Fries培養液(前述預備試驗后選定)三角瓶中，于25 ℃、黑暗條件、120r/min培養箱中振蕩培養。分別于不同時間取樣制備豇豆輪紋病病菌粗毒素。試驗設3次重復。

培養pH篩選。設置pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共8個梯度處理。將直徑0.5 cm菌餅移入Fries培養液三角瓶中，培養溫度25 ℃，15 d后取樣制備豇豆輪紋病病菌粗毒素。試驗設3次重復。

培養溫度篩選。設置溫度為5、10、15、20、25、30、35 ℃計7個培養溫度處理。將直徑為0.5 cm菌餅移入Fries培養液三角瓶中分別培養，15 d后取樣制備豇豆輪紋病病菌粗毒素。試驗設3次重復。

培養光照條件篩選。選擇3種條件：24 h光照、24 h黑暗、12 h光照和12 h黑暗交替。將直徑0.5 cm菌餅移入Fries培養液中，于25 ℃、120r/min培養箱中振蕩培養。15 d后取樣制備豇豆輪紋病病菌粗毒素。試驗重復3次。

振蕩條件篩選。設置24 h振蕩、24 h靜置、12 h靜置12 h振蕩3種條件。將直徑0.5 cm菌餅移入Fries培養液三角瓶中，25 ℃、黑暗、120r/min培養箱中培養。15 d后取樣制備豇豆輪紋病病菌粗毒素。試驗重復3次。

1.3.2 病原菌粗毒素活性的測定

葉片測定法。豇豆植株上的健康葉片用無菌水洗凈，采用針刺法將蘸有1mL粗毒素的脫脂棉放入傷口上，25 ℃光照保濕培養，3d后觀察葉片處理部位的病變情況。以空白培養液為對照。

幼苗浸漬法。取大約8 cm株高的豇豆幼苗，放入裝有5 mL豇豆輪紋病粗毒素的試管內培養，觀察幼苗生長情況，以空白培養液為對照。

不同植物敏感性測定。播種茄子、番茄、花生、大豆等作物，待作物4～6片葉時，采用針刺法,以蘸有豇豆輪紋病病菌粗毒素的脫脂棉接種供試植株葉片上，保濕培養觀察葉片針刺部位發病情況，測量病斑直徑大小。以空白培養液為對照。

1.3.3 粗毒素的生物活性測定

取粗毒液5 mL注入培養皿中作為種子萌發培養液，每皿放入20粒豇豆種子。重復5次。置于25 ℃黑暗條件下培養36h，計測豇豆種子萌發數及胚芽長度，計算萌發率和胚芽抑制率。

胚芽生長抑制率(%) =

1.3.4 數據統計與分析

每個處理重復5次，所得數據用SPSS和Excel軟件分析。

2 結果與分析

2.1 不同條件對病原菌毒素產生的影響

不同的培養基病原菌毒素的產生量不同，在查彼培養液中的產生量最大，種子萌發抑制率及胚芽抑制率均達到80%以上，其次為Fries培養液，產生粗毒素最少的為PD培養液(表1)。

表1病菌在不同培養液產生的粗毒素對豇豆種子萌發和胚芽生長抑制率的影響1)

Table1Effectofcrudetoxinunderdifferentculturemediaontheinhibitoryrateofcowpeaseedgerminationandgermgrowth

培養液Culturemedia種子萌發抑制率/%Inhibitionrateofseedgermination胚芽生長抑制率/%Inhibitionrateofgermgrowth PD28．89e18．95f PS41．11d35．73e Rich45．56d54．57d Fries70．00c70．66c Czapek83．33b81．18b CK98．00a98．00a

1) 根據Duncan分析，同列數據后相同小寫字母表示數據間無顯著性差異(P=0.05)。 Within the same column,the means with the same lowercase letters indicate no significant difference atP=0.05 according to Duncan’s analysis of variance.

不同培養時間對病原菌粗毒素的影響見圖1。在培養3～15 d之間，隨著時間的延長，種子萌發、胚芽生長抑制率逐漸變大并且從圖中可知曲線的斜率較大，因此毒素的產生與培養時間具有一定的正相關。在15 d時無論種子萌發抑制率還是胚芽生長抑制率均達到80%以上；在15～21d時，病原菌粗毒素隨著時間的延長種子萌發及胚芽生長抑制率均下降。據此認為，病原菌產毒的最佳培養時間為15 d。

不同pH對病原菌粗毒素的影響根據圖2結果可知，豇豆輪紋病病原菌在pH 2～9之間均可產生毒素。在pH 2～8間，病原菌粗毒素的產生量隨pH值的增加而增加。在pH 8時，抑制率最大，種子萌發抑制率71.35%，胚芽生長抑制率72.68%。當pH為9時，抑制率下降為50%以下。據此確定病原菌產毒最佳pH為 8。

圖1 病菌在不同時間產生的粗毒素對豇豆種子萌發和胚芽生長抑制率的影響Fig.1 Effect of crude toxin under different culture time on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

圖2 病菌在不同pH產生的粗毒素對豇豆種子萌發和胚芽生長抑制率的影響Fig.2 Effect of crude toxin under different pH values on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

不同溫度對病原菌粗毒素的影響見圖3。由圖3可知，病原菌粗毒素在5～35 ℃之間均可產生，對種子萌發及胚芽的抑制率隨著溫度的升高逐漸增高。在25 ℃時種子萌發抑制率達到最大為72.22%，胚芽生長抑制率為62.33%；而其后隨著溫度的升高抑制率逐漸降低，在35 ℃時種子萌發抑制率僅為28.89%，胚芽生長抑制率為38.36%。由此可知，豇豆輪紋病菌粗毒素在25 ℃時產生量最大。

不同光照對病原菌粗毒素的影響見圖4。由圖4可知，光照條件下種子萌發抑制率達63.33%，胚芽生長抑制率為65.75%；而黑暗條件下種子萌發抑制率為48.89%，胚芽生長抑制率為49.32%。表明光照條件有利于病原菌粗毒素的產生。

圖3 病菌在不同溫度條件下產生的粗毒素對豇豆種子萌發和胚芽生長抑制率的影響Fig.3 Effect of crude toxin under different temperatures on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

圖4 病菌在不同光照條件下產生的粗毒素對豇豆種子萌發和胚芽生長抑制率的影響Fig.4 Effect of crude toxin under different light conditions on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

不同振蕩條件對病原菌粗毒素的影響測定結果見圖5。不同振蕩條件對病原菌粗毒素的產生影響不同。間歇振蕩利于病原菌粗毒素產生，種子萌發抑制率達74.44%，胚芽生長抑制率為70.55%；而靜止培養下抑制率僅為40%。因此間歇振蕩培養利于病原菌粗毒素產生。

2.2 病原菌毒素活性測定結果

針刺豇豆葉片接種粗毒素，3d后觀察到葉片上可產生類似于真菌感染后產生的病斑，病斑中心成黃褐色枯斑，周圍產生黃色暈圈，具明顯的同心輪紋。表明病菌粗毒素對葉片細胞組織具有致病危害作用。試驗結果為毒素在病程中是主要致病因子提供了佐證(圖6)。

圖5 病菌在不同振蕩條件下產生的粗毒素對豇豆種子萌發及胚芽生長抑制率的影響Fig.5 Effect of crude toxin under different shaking conditions on the inhibitory rate of cowpea seed germination and germ growth

圖6 針刺葉片接種毒素后的癥狀(24 h)Fig.6 Leaf symptoms after stab inoculation with the toxin(24 h)

幼苗浸漬致萎法測定表明，豇豆輪紋病病菌粗毒素可以對豇豆幼苗產生明顯的毒害作用。毒素處理24 h后，豇豆幼苗開始脫水呈現青枯狀，48 h后，用毒素處理的幼苗完全脫水萎蔫(圖7)。

圖7 毒素處理后萎蔫(2 d)Fig.7 Wilting after treatment with toxin(2 d)

不同寄主對粗毒素的敏感性測定結果表明(表2)，針刺接種3d后，10種供試植物中，豆科及茄科作物植株均產生不同程度的病斑，其中大豆、菜豆、茄子上的病斑較大，分別為2.0、1.2、1.5 cm；然而葫蘆科作物中的黃瓜及西葫蘆均未產生病斑，絲瓜病斑直徑為1.2 cm；番茄、辣椒、花生病斑相對較小。

表2不同寄主上毒素致病反應測定1)

Table2Toxicitydeterminationofthecrudetoxinondifferenthostplants

寄主植物Hostplant病斑直徑/cmDiameteroflesions寄主植物Hostplant病斑直徑/cmDiameteroflesions番茄Tomato0．5e花生Peanut0．3f辣椒Pepper0．2f大豆Soybean2．0a茄子Eggplant1．5b西葫蘆Squash0g 菜豆Bean1．0d黃瓜Cucumber0g 豇豆Cowpea1．2c絲瓜Suakwavegetablesponge1．2c

1) 不同小寫字母表示0.05水平差異顯著。 Different small letters indicated significant difference at 0.05 level.

3 討論

植物病原菌毒素能使寄主產生特定癥狀反應，在植物病害發生、發展過程中具有明顯致病或致毒作用，是一類重要的致病因子[5-6]。1975年Onesirosan等[7]最先報道了多主棒孢能產生毒性物質。1983年，Toder[8]研究表明：病菌致病粗毒素在適當的選擇劑量下可用于篩選高抗病水平的突變體。然而培養基內毒素的產生量直接受培養基成分和外界環境條件的影響[9-10]。因此為了篩選出抗病突變體，病原菌粗毒素培養條件的篩選是其基礎，但是在國內尚無報道豇豆輪紋病粗毒素培養條件的篩選。本研究結果表明：豇豆輪紋病產毒最適培養液為查彼培養液，光照有利于病原菌粗毒素的產生。病原菌在0～35 ℃之間均可產生毒素，在25 ℃時毒素的產量最高。在pH 8的條件下粗毒素產生最多，振蕩可以促進病原菌粗毒素的產生。隨著時間的延長病原菌粗毒素產生量逐漸增加，在15 d時達到最大。病原菌毒素活性測定結果顯示，針刺接種的離體葉片在48 h后即可產生直徑為1cm的病斑，幼苗浸漬在毒素中48 h后萎蔫，由此可知病原菌粗毒素的致病性較高。在10種供試寄主植物中，病原菌粗毒

素可以侵染7種，其中大豆、茄子、菜豆等測試植株病斑最大達到1cm以上，從而證明其侵染寄主范圍之廣。因此，在生產實踐中，應將豇豆與大豆、茄子、菜豆等敏感作物分離種植，避免作物之間的交叉感染，引起病害的蔓延，造成經濟損失。

本研究證實了豇豆輪紋病病菌粗毒素的致病性,明確了豇豆輪紋病病菌的產毒條件及致病性,為毒素的純化和進一步深入研究其理化特性、活性組分、致病機理及利用毒素進行抗病品種篩選提供了理論基礎。

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OptimizationofculturingconditionsfortoxinproductionbyCorynesporacassiicola

Liu Zhiheng1, Li Jianbing1, An Xin1, Li Wei1, Cao Youwen2, Wang Junhe1

(1.PlantProtectionCollege,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China；2.PlantProtectionStationofZhangwuCounty,Fuxin123200,China)

Toxin production byCorynesporacassiicolawas investigated under different culture medium,culturing duration,temperature,pH,light or shaking conditions by determining the inhibitory rate of seed germination and germ growth.The results showed that toxin activity was different under different culture conditions.The optimal culture conditions were as follows: pH 7-8,20-25 ℃,culturing in Czapek’s liquid medium under light and shaking conditions for 15 h.Toxicity bioassay demonstrated that the crude toxin had high toxicity to soybeans and kidney beans with the larger lesion,while no toxicity to cucumber plants.

cowpea ring spot;Corynesporacassiicola; toxin; activity

2013-06-12

：2013-11-25

S 436.43

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.010

* 通信作者 E-mail: lzhh1954@163.com