球孢白僵菌SJ-05幾丁質酶基因的克隆與序列分析

楊 帆, 劉春來, 段立清

(1.黑龍江省農業科學院植物保護研究所，哈爾濱 150086； 2.內蒙古農業大學農學院，呼和浩特 010019)

球孢白僵菌SJ-05幾丁質酶基因的克隆與序列分析

楊 帆1, 劉春來1, 段立清2*

(1.黑龍江省農業科學院植物保護研究所，哈爾濱 150086； 2.內蒙古農業大學農學院，呼和浩特 010019)

幾丁質酶在昆蟲真菌侵染寄主過程中起著重要的作用。本文對采自內蒙古準格爾旗沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌菌株SJ-05進行了幾丁質酶的基因分析，從中克隆了幾丁質酶Bbchit基因，得到了重組質粒pMD19-T/chit。測序結果表明，Bbchit基因核苷酸序列閱讀框架全長為1047 bp，編碼348個氨基酸，推測分子量為36.924 ku，等電點為5.94。氨基酸序列比對結果表明，與球孢白僵菌Bb0062菌株(AAN41259.1)的氨基酸序列相似性最高，為99.71%。

球孢白僵菌； 幾丁質酶基因； 基因克隆； 序列分析

沙棘是我國黃土丘陵區的水土保持樹種之一，也是當地主要薪炭材，整株植株均含有豐富的營養和生物活性物質，具有較高的綜合開發利用價值。但是，近年來，沙棘木蠹蛾(HolcocerushippophaecolusHua,Chou,FangetChen)時有發生，為害嚴重，造成沙棘林大面積死亡。內蒙古鄂爾多斯市沙棘木蠹蛾發生面積大，約1.8萬hm2，平均有蟲株率高達42%[1]。調查發現白僵菌是沙棘木蠹蛾幼蟲、蛹的主要病原物，是值得開發利用的病原物之一。

球孢白僵菌[Beauveriabassiana(Balsamo) Vuillemin]是常見的昆蟲病原真菌之一，寄主范圍廣，致病力強，對人、畜、天敵無毒害，不污染環境，廣泛應用于農林害蟲的生物防治。昆蟲病原菌在入侵寄主體壁的過程中會產生相關的酶類，其中主要是蛋白酶、幾丁質酶及脂酶等水解酶類[2]。當這些酶類作用于昆蟲表皮時，協同運作[3]，可降解由蛋白質、幾丁質和脂類等物質組成的昆蟲體壁[4]，使孢子更容易吸附在寄主昆蟲體表上，利于芽管侵入體表，同時也為菌絲的生長提供了營養物質，使菌絲成功侵入昆蟲體腔[5]。這些酶類在球孢白僵菌侵入寄主過程中起重要作用[6]。

幾丁質酶由于其有效降解幾丁質，在害蟲防治中得到了廣泛的研究，它是由N-乙酰-D-氨基葡糖殘基以β-1,4糖苷鍵連接而成的不分枝鏈狀多糖。幾丁質酶存在于昆蟲、線蟲、真菌、一些藻類[7]和酵母中。在昆蟲中，幾丁質酶主要作用時間有限，如蛻皮前。幾丁質酶是一種誘導酶，以幾丁質為作用底物的水解酶，在以昆蟲體壁為唯一碳氮源的培養基中和穿透寄主體壁時都能表達[8]。在環境不太適合期間過度降解幾丁質會引起昆蟲生理紊亂，導致昆蟲死亡[9]。在植物體內，為增強其防御機制，幾丁質酶基因也可以表達。從煙草天蛾中獲得的幾丁質酶基因，通過轉基因煙草植物表達后，顯著降低了煙草夜蛾幼蟲的生長。為研究害蟲防治，同來自許多生物體的幾丁質酶基因被克隆一樣，從致病性真菌中也克隆到了幾丁質酶基因[3，10，15，17]。幾丁質酶是昆蟲病原真菌的一個重要毒力因子。本研究克隆球孢白僵菌SJ-05幾丁質酶基因，并分析該基因編碼的氨基酸序列，為進一步研究幾丁質酶在昆蟲體壁水解過程中的重要作用以及構建高毒力基因工程菌株提供分子水平上的依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

球孢白僵菌SJ-05分離自內蒙古準格爾旗沙棘木蠹蛾幼蟲體。

1.2 主要試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小樣快速抽提試劑盒均購自TIANGEN公司，pMDTM19-T Simple vector、rTaq聚合酶、限制性內切酶Hind Ⅲ及EcoRⅠ均購自TaKaRa公司，X-gal、氨芐青霉素(Ampr)等購自北京鼎國昌勝生物技術有限責任公司，其他常用試劑為國產分析純。

1.3 SJ-05 DNA的提取

將新鮮PSA斜面培養好的球孢白僵菌SJ-05分生孢子接種于液體培養基中，180r/min，26℃，振蕩培養3d，將菌液轉移至50mL無菌離心管中，10000r/min，離心10min，收集菌體，依據植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌體DNA。

1.4 PCR擴增及目的片段回收

上游引物Bb-chi-F：5′-AAGCTTATGGCTCCTTTTCTTCAAAC-3′，引入了Hind Ⅲ酶切位點；下游引物Bb-chi-R：5′-GAATTCTTACGCAGTCCCCA-AAGTCC-3′，引入了EcoRⅠ酶切位點。引物由上海生工北京合成部合成。

PCR擴增體系20μL：10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL，10μmol/L上游和下游引物各1μL，0.5U/mL rTaqDNA聚合酶0.3μL，10ng/μL DNA 5 μL，無菌超純水補足至20μL。反應條件：94 ℃ 5 min； 95℃ 30s； 55℃ 30s； 72℃ 1.5 min， 35個循環；72 ℃ 10min；4 ℃保存。

檢測PCR產物，回收1100bp左右的目的片段。純化產物-20℃保存備用。

1.5 純化產物的連接及轉化

將純化產物與載體在16℃連接過夜(約12 h)后，4 ℃保存。大腸桿菌感受態細胞采用CaCl2法制備。轉化大腸桿菌JM109，進行藍白斑篩選。

1.6 質粒提取及重組質粒鑒定

隨機挑取陽性單克隆，加入5 mL LB(含0.1%的Amp)液體培養基，37 ℃下200r/min振蕩培養約12～16h。取3～5 mL菌液，參照質粒提取試劑盒方法提取，-20℃保存備用。

用Hind Ⅲ、EcoRⅠ雙酶切鑒定重組質粒pMD19-T/chit。經酶切鑒定成功的陽性克隆樣品送Sangon公司進行DNA序列測定。

1.7 序列及進化分析

用DNAMAN軟件及NCBI網站上的BLAST程序完成序列分析。用DNA Star分析軟件完成系統進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 球孢白僵菌SJ-05幾丁質酶基因的克隆及序列分析

提取球孢白僵菌SJ-05 DNA，進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳，得到1100bp左右的特異性PCR條帶，如圖1。將目的片段與pMD19-T載體連接，轉化到大腸桿菌JM109感受態細胞，在含有Amp的LB平板培養基上篩選陽性重組子，挑選其中5個陽性克隆，用Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切鑒定重組克隆，結果表明，5個陽性克隆中均插入了目的片段，大小1100bp左右。

SJ-05幾丁質酶基因序列測定結果表明，該基因含有一個完整的開放閱讀框，閱讀框架全長為1047 bp，幾丁質酶基因編碼348個氨基酸殘基，起始密碼子ATG和終止密碼子TAA。SJ-05幾丁質酶基因的核苷酸序列及對應的氨基酸序列見圖2。

圖1 幾丁質酶基因PCR擴增電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis map for PCR product of chitinase gene

2.2 SJ-05幾丁質酶基因編碼氨基酸序列分析

利用http:∥www.expasy.org/tools/#translate網站提供的蛋白分析軟件對菌株SJ-05幾丁質酶基因編碼氨基酸序列的基本特征進行分析，結果顯示，該基因預測的蛋白質分子量為36.924 ku，等電點為5.94。氨基酸組成中帶正電荷氨基酸(Arg、Lys)23個，占6.6%，帶負電荷氨基酸(Asp、Glu)26個，占7.4%，疏水性氨基酸167個，占47.9%，親水性氨基酸118個，占33.7%，見表1。

MotifScan軟件分析該基因編碼的蛋白位點和序列模式表明，其編碼蛋白可能含有1個N-糖基化位點，2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，11個N-端十四烷基化位點，1個蛋白激酶C磷酸化位點，1個幾丁質酶-18位點，3個糖基水解酶-18位點，其具體位置如表2和圖3所示。

圖2 SJ-05幾丁質酶基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of chitinase gene from SJ-05

表1 幾丁質酶的氨基酸含量1)Table 1 Amino acid content of chitinase

1) *疏水氨基酸，# 親水氨基酸。 *Hydrophobic amino acid,# Hydrophilic amino acid.

表2幾丁質酶氨基酸序列模塊分析結果

Table2Motifanalysisoftheaminoacidsequenceofthepredictedchitinase

模塊名稱Name中文名稱Chinesename數量/個No．位置PositionASN＿GLYC?OSYLATIONN?糖基化位點1334?337CK2＿PHOS?PHO＿SITE酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點2106?109，336?339MYRISTYLN?端十四烷基化位點1152?57，97?102，125?130，165?170，210?215，215?221，258?263，278?283，297?302，317?322，343?348PKC＿PHOS?PHO＿SITE蛋白激酶C磷酸化位點1254?256CHITIN?ASE＿18幾丁質酶?18家族1155?163Glyco＿hy?dro＿18糖基水解酶?18家族341?165，319?330，41?330

圖3 幾丁質酶模塊位置Fig.3 Motif pattern of the predicted chitinase

運用SOPMA軟件http:∥www.expasy.org/tools/#translate預測SJ-05幾丁質酶蛋白的二級結構，表明該蛋白含約30.66%的α-螺旋，8.60%的β-折疊，18.62%的延伸鏈，42.12%的不規則卷曲。該基因編碼的蛋白主要由α-螺旋和不規則卷曲構成，而β-折疊和延伸鏈則散布于整個蛋白質中。在SWISS-MODEL數據庫中進行蛋白質三維結構分析，得到該蛋白的三維結構圖，見圖4。

圖4 球孢白僵菌SJ-05幾丁質酶蛋白三級結構同源建模Fig.4 The 3D structure of the chitinase predicted by Swiss-model

2.3 SJ-05幾丁質酶相似性及分子進化

將球孢白僵菌SJ-05幾丁質酶基因推導的氨基酸序列進行同源比對，SJ-05與已報道的4株白僵菌屬菌株、2株綠僵菌屬菌株、1株木霉屬菌株、1株鏈霉菌屬菌株和2株蘇云金桿菌的幾丁質酶氨基酸序列相似性為99.7%～25.9%，相似性最高的菌株為Bb0062(AAN41259.1)。SJ-05與4株白僵菌屬菌株的相似性為99.7%～98.3%，與2株綠僵菌屬菌株的相似性為80.3%和79.1%，與1株木霉屬04-001菌株的相似性為77.1%，與1株鏈霉菌屬e14菌株的相似性為76.1%，與2株蘇云金桿菌菌株的相似性最低，分別為26.4%和25.9%。相似性比對見圖5。

利用ClustalX2.0和MEG3.1軟件對SJ-05及已選的幾丁質酶基因的氨基酸序列建立的系統進化樹見圖6。

3 結論與討論

彭仁旺等從球孢白僵菌中純化的幾丁質酶分子量分別為32.39 ku和52 ku[11-12]；方衛國等克隆了球孢白僵菌的兩個幾丁質酶基因Bbchit1和Bbchit2，推測分子量分別為33ku左右和46.3ku[13-14]，王定鋒等從茶卷葉蛾球孢白僵菌菌株中克隆的幾丁質酶基因，分子量約為36.78 ku[15]。采自內蒙古準格爾旗地區沙棘木蠹蛾白僵菌中克隆及推測的幾丁質酶基因分子量為36.924 ku，可見，白僵菌菌株間幾丁質酶基因的分子量有一定的差異，控制的酶也有一定差異。哪些酶活性更高有待進一步分析研究。

圖5 幾丁質酶基因所推導的氨基酸序列與其他幾丁質酶氨基酸序列的相似性比較Fig.5 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of chitinase gene and its homologues

球孢白僵菌中存在多種幾丁質酶，在穿透寄主體壁過程中的作用可能也各不相同，因此有必要從昆蟲病原真菌中克隆更多的幾丁質酶基因，用遺傳轉化等手段驗證它們在侵染寄主過程中各自的作用[16]。除此之外，有研究表明，利用基因工程在昆蟲病原真菌中超量表達幾丁質酶基因，構建高毒力菌株，可以有效地增強菌株的毒力[17]；但也有證據表明單一過量表達幾丁質酶基因并不會增強昆蟲病原真菌的毒力[18]，因此，對白僵菌其他酶類的克隆研究也非常重要，應用多種酶活力來評價白僵菌菌株對寄主昆蟲的侵染力。從本研究獲得的球孢白僵菌幾丁質酶基因與已發表的幾丁質酶基因的相似性比較來看，與球孢白僵菌菌株JYBb201-11的核苷酸序列相似性高達99%，與球孢白僵菌菌株Bb0062(AAN41259.1)的氨基酸序列相似性最高，為99.71%。研究幾丁質酶基因有助于揭示幾丁質酶在侵染寄主過程中的重要作用，推測其與殺蟲毒力存在的相關性[19]。

圖6 幾丁質酶基因推導的氨基酸序列與其他幾丁質酶基因的氨基酸序列的進化樹比較Fig.6 Phylogenetic relationships of the deduced amino acid sequences of chitinase gene and its homologues

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CloningandsequenceanalysisofchitinasegenefromBeauveriabassianaSJ-05

Yang Fan1, Liu Chunlai1, Duan Liqing2

(1.InstituteofPlantProtection,HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China;2.CollegeofAgronomy,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010019，China)

The chitinase plays an important role in the infection of entomogenous fungus to its host insects.Chitinase gene was amplified and cloned fromBeauveriabassianaSJ-05 isolated from cadaver ofHolcocerushippophaecoluslarvae in the Jungar Banner,Inner Mongolia,and recombinant plasmid pMD19-T/chit was constructed.The results showed thatBbchitgene was 1047 bp in size and encoded 348 amino acids.The molecular weight and theoretical isoelectric point were 36.924 ku and 5.94,respectively.The deduced amino acid ofB.bassianaSJ-05 chitinase gene shared 99.71% homology with that ofB.bassianaBb0062.

Beauveriabassiana; chitinase gene; gene cloning; sequence analysis

2013-02-21

：2013-12-12

國家林業局“948”項目(2006-04-29)

S 476.12

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.013

* 通信作者 E-mail: duanlq2013@163.com