應用細菌磁顆粒real-timeRT-PCR檢測百合無癥病毒

鄧叢良，雙龍海，孫 寧,2，陳繼峰，魏海燕

(1.北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，北京 101312； 2.東南大學生物科學與醫學工程學院，南京 210096； 3.鄭州大學生物工程系，鄭州 450001)

應用細菌磁顆粒real-timeRT-PCR檢測百合無癥病毒

鄧叢良1*，雙龍海1，孫 寧1,2，陳繼峰3，魏海燕1

(1.北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，北京 101312； 2.東南大學生物科學與醫學工程學院，南京 210096； 3.鄭州大學生物工程系，鄭州 450001)

為研究細菌磁顆粒分離提取不同樣本材料中的植物病毒RNA的效果，以及結合實時熒光 RT-PCR技術檢測LSV的靈敏性，選取感染病毒的西葫蘆葉片(CGMMV和SqMV)、大豆種子(BPMV)與百合葉片(LSV和ArMV)3種樣本材料，利用細菌磁顆粒分別提取這5種病毒RNA，與Trizol方法提取效果進行比較，同時與Trizol real-time RT-PCR檢測LSV的靈敏度進行了比較。結果表明：BMPs方法能夠從3種植物樣本中提取病毒RNA，其檢測LSV的靈敏性與Trizol方法相當。

細菌磁顆粒； 實時熒光 RT-PCR； 靈敏度

納米材料是指在三維空間上至少有一維在0～100nm以內或者以此為基本結構單元而組成的材料，其具有小尺寸效應，量子效應，以及比表面積大等特性[1]。磁性納米顆粒是一種單磁疇的納米粒子，只有當處于外部磁場中才會顯現出磁性，而且由于其尺寸小、比表面積大，能夠與靶標物充分的結合，是用于固相分離的良好介質[2]。細菌磁顆粒是一種分離自趨磁細菌的生物納米磁性顆粒，具有良好的生物相容性，表面主要由磷脂酰乙醇胺與磷脂酰甘油組成的磷脂膜包裹，表面分布有游離的氨基，能夠進行通過物理吸附或借助化學偶聯劑與功能生物分子或藥物相連，可用于治療、診斷以及檢測等方面的應用[3-6]。

植物病毒的檢測方法主要有鑒別寄主、血清學、電鏡觀察和分子生物學[7]。鑒別寄主方法雖然能夠對病毒感染植物癥狀更直觀的觀察，但很難對病毒的種屬進行準確鑒定；DAS-ELISA是目前最為常用植物病毒檢測方法，但是這種方法依靠高靈敏性的血清，否則容易造成假陰性；電鏡觀察的制樣較為復雜，而且對病毒檢測來說，也容易受到電鏡視野的限制；分子生物學方法，主要是通過分子雜交、擴增等技術對病毒核酸進行分析，具有靈敏度高，特異性好的優點，但是對于從復雜的植物樣本材料中提取病毒核酸，特別大多為RNA時，目前常用的提取技術，如利用有機溶劑(苯酚、氯仿等)抽提，具有耗時長、對操作人員身體易造成傷害等缺點。因此，必須發展新型的植物病毒提取技術。

近年來，采用化學合成的磁性納米顆粒在富集提取核酸方面，展現出非常巨大的優勢。相比于化學合成的，細菌磁顆粒生物相容性與均一性更為優良。因此，本文利用納米級細菌磁顆粒(bacterial magnetic particles，BMPs)比表面積大，分散性好，與病毒粒子非特異結合的特性，分別對感染黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)和南瓜花葉病毒(Squashmosaicvirus，SqMV)的西葫蘆葉片，感染菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus，BPMV)的大豆種子，感染百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)與南芥菜花葉病毒(Arabismosaicvirus,ArMV)的百合葉片這3種植物樣本材料進行病毒核酸提取，結合實時熒光RT-PCR技術進行檢測，驗證其對不同樣本材料提取的可靠性，同時對細菌磁顆粒實時熒光RT-PCR技術檢測LSV的靈敏性與常用的Trizol試劑方法進行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料

攜帶CGMMV和SqMV的西葫蘆葉片、攜帶BPMV的大豆種子、攜帶LSV和ArMV的百合葉片以及相應的陰性材料均由本實驗室保存。Trizol試劑購自Invitrogen公司，M-MLV反轉錄酶和實時熒光PCR試劑盒均購自TaKaRa公司。細菌磁顆粒由鄭州大學陳繼峰博士提供。Real-time RT-PCR引物與探針見表1。

表1Real-timeRT-PCR引物與探針

Table1Primersandprobesforreal-timeRT-PCR

病毒Virus引物與探針Primerandprobe序列Sequence(5′?3′)CGMMV上游引物(Senseprimer)5′?GCGGGTTTTTACGCTTTCC?3′下游引物(Anti?senseprimer)5′?CGTATCCGTGGAGCTGAGAAG?3′探針(Probe)5′?FAM?ACGGTCCTGTGTTGAGGCCTATCTTCG?BHQ1?3′SqMV上游引物(Senseprimer)5′?CGCACCCATGTTATAAGAGGC?3′下游引物(Anti?senseprimer)SqMV?RP5′?ATAGCCAAAGCACAACCTGTATT?3′探針(Probe)5′?FAM?ACGCTGTGTTGCTTCTATCAATGTTCCA?BHQ1?3′BPMV上游引物(Senseprimer)5′?CTCTCCTTACATTAAATGTACAGTGTCTT?3′下游引物(Anti?senseprimer)5′?AACTTATTCCTGAATTTCTCCAAACT?3′探針(Probe)5′?FAM?TTCATAGCATTTGGAAATTTGGCTGATGA?BHQ1?3′LSV上游引物(Senseprimer)5′?CCCCTACGGGAGATTCTCAA?3′下游引物(Anti?senseprimer)5′?GGTTGCCATGTTGTTAGATACGA?3′探針(Probe)5′?FAM?TGACGAACTCTTCAAGATGAAGGTTGGC?BHQ1?3′ArMV上游引物(Senseprimer)5′?GCACTGTAGCCCTTGGAGATAATCC?3′下游引物(Anti?senseprimer)5′?CCCTCCAAATCCCACATTAACTTA?3′探針(Probe)5′?FAM?CTCACATGATAGCTTGTCATGGACTCC?TAMRA?3′

1.2 病毒RNA提取

稱取樣本材料各100mg，分別利用Trizol方法與BMPs方法提取病毒RNA。Trizol方法參考試劑說明進行提取，稱取100mg樣本材料，將最后獲得的沉淀溶于500μL RNase Free water。BMPs方法參考文獻[5-6]，同樣稱取100mg樣本材料，加入1mL研磨緩沖液，離心后取100μL上清液，利用BMPs分離病毒粒子，加入50μL RNase free water，95 ℃孵育5 min，釋放病毒RNA。

1.3 BMPs real-time RT-PCR檢測

利用BMPs方法分別提取攜帶CGMMV和SqMV的西葫蘆葉片、攜帶BPMV的大豆種子以及攜帶LSV和ArMV的百合葉片的RNA，然后進行實時熒光RT-PCR檢測，以Trizol方法提取陽性與陰性樣本RNA作為陽性與陰性對照。

1.4 靈敏性比較

分別取100mg含LSV的陰性與陽性百合葉片組織，加入1mL研磨緩沖液進行研磨，離心，取20μL陽性材料上清液，利用陰性材料上清液進行梯度稀釋，稀釋倍數為10n(n=1、2、3……6)，分別利用BMPs方法與Trizol方法提取病毒RNA，通過real-time RT-PCR進行檢測，比較兩者的靈敏性。

1.5 Real-time RT-PCR

在200μL離心管中加入5 μL RNA與1μL下游引物(10μmol/L)，70℃水浴10min，立即置于冰上2 min，而后依次加入2 μL 5×M-MLV Buffer，0.5 μL dNTP Mixture(10mmol/L)，0.25 μL M-MLV(200U/μL)，0.25 μL RNase Inhibitors(40U/μL)，補足無RNase free water至10μL，42 ℃溫育60min，70℃ 10min滅活反轉錄酶，冰上放置2 min。

在一個潔凈的200μL離心管中依次加入2 μL反轉錄產物、10μL Premix ExTaq(2×)、上游引物(10μmol/L)和下游引物(10μmol/L)各0.4 μL、0.2 μL探針(10μmol/L)，補足去離子水至20μL。擴增程序：95 ℃ 10s；95 ℃ 5 s，60℃ 20s，40個循環。

2 結果與分析

2.1 BMPs real-time RT-PCR檢測

圖1為利用BMPs方法分別提取西葫蘆葉片組織(CGMMV與SqMV)、大豆種子(BPMV)與百合葉片(LSV與ArMV)3種不同樣本材料中的病毒RNA進行real-time RT-PCR檢測的擴增曲線。從相對熒光強度(ΔRn)對循環數(cycle)的擴增曲線可以看到，BMPs方法能夠準確的分別從3種樣本材料中提取出病毒RNA，隨循環數的增大，ΔRn升高，均擴增曲線，而陰性材料的均有沒有擴增，與Trizol real-time RT-PCR檢測結果一致，檢測CT值見表2。

圖1 Real-time RT-PCR檢測Fig.1 Real-time RT-PCR detection

表2Real-timeRT-PCR檢測CT

Table2CTvaluesofreal-timeRT-PCRdetection

樣本材料Sample病毒VirusBMPsreal?timeRT?PCR(CT)陽性Positive陰性NegativeTrizolreal?timeRT?PCR(CT)陽性Positive陰性Negative西葫蘆葉片ZucchinileavesCGMMVSqMV22．6520．46404020．7817．954040大豆種子SoybeanseedsBPMV36．574032．5240百合葉片LilyleavesLSVArMV29．2335．35404027．8534．914040

2.2 BMPs real-time RT-PCR檢測LSV靈敏性

BMPs real-time RT-PCR檢測LSV如圖2，CT值隨稀釋梯度的增大而增大，當稀釋梯度為10-6時，擴增沒結果沒有超過閾值，其CT值為40，各梯度檢測CT值依次為22.65、25.31、28.48、31.45、34.68、40，其陰性對照CT為40。結果表明：BMPs real-time RT-PCR檢測LSV的稀釋限點為10-5。

2.3 Trizol real-time RT-PCR檢測LSV靈敏性

圖3為Trizol real-time RT-PCR檢測LSV靈敏性結果。從圖中可以看到，隨著陽性材料稀釋倍數的增大，檢測CT值依次增大，當稀釋梯度為10-6時，相對熒光強度(ΔRn)沒有超過閾值，其CT值依次為20.97、23.27、28.66、33.54、37.77、40，陰性對照曲線沒有擴增(CT=40)。結果表明：Trizol real-time RT-PCR檢測LSV稀釋限點為10-5。

圖2 BMPs-based real-time RT-PCR檢測靈敏性Fig.2 Sensitivity of BMPs-based real-time RT-PCR detection

圖3 Trizol real-time RT-PCR檢測靈敏性Fig.3 Sensitivity of Trizol-based real-time RT-PCR detection

3 討論

本研究利用細菌磁顆粒(BMPs)提取了多種樣本材料中的植物病毒RNA，并結合real-time RT-PCR技術對病毒進行了檢測。對于不同的樣本材料(西葫蘆葉片、大豆種子和百合葉片)均具有很好的提取和檢測效果。但是，BMPs方法提取的病毒核酸的濃度要低于Trizol試劑(real-timeRT-PCR的CT)，尤其是對于大豆種子材料，其CT值要高大約3個CT值，這表明其核酸濃度要低近10倍。這可能是由于大豆種子豐富的蛋白質占據了病毒粒子的吸附位點，造成病毒核的提取量比較低。同時，相比于大豆種子材料，葉片材料病毒核酸的提取效果與Trizol試劑相差不多。

此外，對于檢測百合葉片LSV的靈敏性進行了測定，并與Trizol real-time RT-PCR檢測百合葉片LSV的靈敏性相比，具有相同的檢測靈敏性，表明該檢測方法具有很好的靈敏性。

細菌磁顆粒(BMPs)具有良好的生物相容性，同時由于表面分布有游離的氨基，造成粒子之間相互排斥，在水溶液中分散性好，當與樣本溶液混合時，能夠與病毒粒子發生相互作用，利用外加磁場，將BMPs與病毒的復合物從樣本溶液中分離出來。本實驗室通過研究建立了提取植物病毒RNA的BMPs方法，并將此方法與實時熒光RT-PCR技術相結合，應用于檢測多種植物病毒，此方法具有以下三個優點：1)特異性好，實時熒光RT-PCR技術具有靈敏性好，特異性高；2)操作簡單，耗時短；3)不需要使用有機溶劑，避免對操作人員健康帶來損傷。

[1] 沈海軍.納米科技概論[M].北京: 國防工業出版社,2007.

[2] K?ppler T E,Hickstein B,Peuker U A,et al.Characterization of magnetic ion-exchange composites for protein separation from biosuspensions[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2008,105(6): 579-585.

[3] Chen J F,Li Y,Wang Z F,et al.High-sensitivity detection of fruit tree viruses using bacterial magnetic particles[J].Journal of Integrative Plant Biology,2009,51(4): 409-413.

[4] Schüler D,Frankel R B.Bacterial magnetosomes: microbiology,biomineralization and biotechnological applications[J].Applied Microbiology Biotechnology,1999,52: 464-473.

[5] 孫寧,鄧叢良,么磊,等.應用細菌磁顆粒實時熒光RT-PCR檢測南瓜花葉病毒[J].植物病理學報,2010,40(6): 632-635.

[6] 孫寧,張一折,陳繼峰，等.應用細菌磁顆粒RT-PCR檢測3種植物病毒[J].植物檢疫,2010,24(6): 16-19.

[7] 鄧叢良,江明,汪萬春，等.應用MNP-RT-PCR方法檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒[J].植物病理學報,2008,38(4): 436-440.

Applicationofbacterialmagneticparticle-basedreal-timeRT-PCRfordetectingLilysymptomlessvirus

Deng Congliang1, Shuang Longhai1, Sun Ning1,2, Chen Jifeng3，Wei Haiyan1

(1.TestingCenterofBeijingInspectionandQuarantineBureau,Beijing101312,China; 2.CollegeofBiologicalandMedicalEngineering,SoutheastUniversity,Nanjing210096,China; 3.DepartmentofBioengineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

To evaluate the effectiveness of the BMPs-based method,which was used for extracting plant viral RNAs from different samples,cucurbita pepo leaves (infected by CGMMV or SqMV),soybean seeds (infected by BPMV),and lily leaves (infected by LSV or ArMV) were extracted by BMPs-based real-time RT-PCR.The effectiveness and sensitivity of BMPs-based real-time RT-PCR were compared with that of the Trizol-based method.The results indicated that the BMPs-based method was effective for separating and extracting plant viral RNAs,and the sensitivity for detecting LSV using BMPs-based real-time RT-PCR equals that of the Trizol-based real-time RT-PCR.

bacterial magnetic particles (BMPs); real time RT-PCR; sensitivity

2013-02-22

：2013-10-16

公益性行業(質檢)科研專項(201110035)；國家質檢總局科技計劃項目(2010IK179)

S 432.41

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.018

* 通信作者 E-mail: dengcl@bjciq.gov.cn