氯碘羥喹對實驗性腦出血大鼠銅藍蛋白表達的影響

陳艷麗，王改青，尹永峰，趙瑞

論著·基礎

氯碘羥喹對實驗性腦出血大鼠銅藍蛋白表達的影響

陳艷麗，王改青，尹永峰，趙瑞

目的研究金屬螯合劑氯碘羥喹(CQ)干預大鼠腦出血(ICH)后鐵超載狀態下銅藍蛋白(Cp)的表達。方法將48只Wistar大鼠隨機分為2組：對照組、干預組各24只，均采用立體定向技術向大鼠尾狀核區注射膠原酶制備ICH模型，制模成功后干預組給予氯碘羥喹50 mg/kg灌胃， 1次/12 h；對照組用等量生理鹽水灌胃。2組在術后1、3、7、14 d不同時間點各取6只大鼠斷頭取腦，采用免疫組化染色和實時熒光定量PCR檢測Cp的表達。結果ICH模型制備后，隨著時間延長2組Cp陽性表達數顯著增加，在第7天達峰值；與對照組相比，干預組大鼠腦組織內Cp在第1天無統計學差異(P>0.05)，在3～14 d的表達均升高(P<0.05)。2組Cp mRNA表達水平高峰出現在第7天，且第3、7、14 d均高于第1天表達水平(P<0.05)。與對照組比較，干預組第3、7、14天Cp mRNA表達水平較高(P<0.05)。結論CQ通過調節腦出血后腦組織內銅藍蛋白的表達，可能加速腦組織內鐵離子的清除從而發揮腦保護作用。

氯碘羥喹;腦出血;銅藍蛋白;大鼠

氯碘羥喹(clioquinol,CQ)是一種膜通透性強，且能通過血腦屏障的2價金屬離子螯合劑。近年來研究表明CQ能調節腦內金屬離子穩態，對預防和治療神經退行性疾病有潛在的臨床應用價值。腦出血后，隨著血紅蛋白的分解，局部鐵離子濃度持續升高，成為腦出血(ICH)繼發性腦損傷的重要因素之一[1]。鐵作為一種可變金屬，通過Fenton反應可產生大量活性氧激發氧化壓力，引起腦組織脂質過氧化、蛋白質氧化及DNA的破壞[2]。由于游離Fe2+參與活性氧的形成并在腦出血的損害機制中起主要作用，故對Fe2+的有效結合及轉運可能預防或減輕鐵超載所致的繼發性損害[3]。目前關于腦出血后鐵離子代謝和鐵轉運蛋白的研究很多，但腦出血后鐵超載的清除機制及腦內鐵相關轉運蛋白的調控機制尚不明確。本實驗擬通過CQ對亞鐵離子的螯合作用，動態觀察銅藍蛋白(Ceruloplasmin，Cp)表達的變化，進一步明確ICH后鐵離子的清除機制，同時為腦出血的臨床治療開辟新思路，提供理論依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：3月齡雄性Wistar大鼠48只，體質量250～300 g，標準飼料喂養和自由飲水，飼養室溫度20～25℃，濕度適中，由山西醫科大學動物實驗中心提供。按數字表隨機分為對照組和干預組各24只 ，每組造模術后,1、3、7、14 d 4個時間點各取6只大鼠進行觀測。(2)試劑與儀器：氯碘羥喹(武漢鴻信康精細化工有限公司生產)，江灣型腦立體定位儀(淮北正華生物儀器設備有限公司)，微量注射器(上海高鴿工貿有限公司生產)，膠原酶(上海杰美生物有限公司抗大鼠生產)， 兔抗大鼠Cp抗體(博奧森生物公司生產)，SABC免疫組化試劑盒(博士德生物試劑公司生產)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物工程公司生產)， PCR試劑盒及引物設計(大連寶生物工程有限公司生產)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠ICH模型制備：48只大鼠以4%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉，腦立體定位儀固定大鼠，頭正中約15 mm 縱行手術切口，暴露前囟，右側中線旁1.3 mm,前囟后3.2 mm為穿刺點，用大頭針鉆透顱骨，微量注射器抽取含0.5 U膠原酶生理鹽水2 μl,迅速插入鉆好的孔內，向內進針5.8 mm。在2 min內注射完畢，留針15 min后緩慢退針。拔針后無清亮液體自針道返流，大鼠蘇醒后出現神經功能缺損癥狀視為造模成功，回籠飼養。經預實驗證實模型成功的判斷標準：術后見明顯的肢體癱瘓，沿針道冠狀面切開腦組織可見基底節區血腫形成。各組術后各相應時間點按參照文獻[4]進行神經功能障礙評分,最高分18分，最低分3分，分數越低神經功能障礙越重。干預組CQ 50 mg/kg灌胃,1次/12 h，對照組用等量生理鹽水灌胃。2組造模后于1、3、7、14 d 4個時間點各取6只大鼠腦組織進行標本制作。

1.2.2 標本制作：各組腦出血模型大鼠在各個時間點，以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉后，斷頭取腦，以針眼為中心做冠狀切面，額部用錫箔紙包裹，置于-80℃冰箱保存用于PCR檢測；余下標本固定于4%多聚甲醛液72 h，石蠟包埋，連續切片，厚約4 μm,行免疫組化染色。

1.2.3 免疫組化染色：石蠟切片常規脫蠟至水,用新鮮配制的3% H2O2液處理10 min,雙蒸水洗3次;切片浸入0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0),并電爐加熱至沸騰后2 min斷電。冷卻后0.1 mol PBS(pH 7.2～7.4)洗滌2次;滴加正常山羊血清封閉液,37℃ 20 min。滴加稀釋的一抗(最佳稀釋濃度 1∶300),-4℃過夜。0.1 mol PBS洗2 min×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 20 min。0.1 mol PBS洗2 min×3次;滴加試劑SABC,37℃ 20 min。PBS洗5 min×4次;取1ml雙蒸水,加DAB顯色試劑盒中A、B、C試劑各1滴,混勻后加至切片上,室溫顯色,鏡下控制反應時間,觀察DAB顯色完全后用雙蒸水洗滌中止反應;蘇木素輕度復染。脫水、透明及封片。

1.2.4 實時熒光定量PCR：取血腫周圍腦組織進行RT-q PCR分析。采用Trizol試劑提取腦組織總RNA。采用TaKaRa逆轉錄試劑盒，按操作說明將組織總RNA逆轉錄成cDNA；Cp引物上游序列：5'-GGCTCCAAGAGGAAGAAACAT-3',下游序列：3'-CCAGAAGCATAGTCCCAAACTG-5'，擴增片段長132 bp;β-actin引物上游序列：5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游序列：3'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-5',擴增片段長150 bp。擴增條件：95℃預變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s。循環40次。應用ABI7300型擴增儀圖像處理系統分析。

1.3 檢測指標

1.3.1 免疫組化染色：普通光學顯微鏡觀察細胞漿和胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞。每張切片在40倍物鏡下選擇缺血半暗帶區相鄰而不重疊的5個視野區，計數陽性細胞數，取平均值為測量值。

1.3.2 PT-qPCR 分析：PCR擴增結束后，記錄每個反應管中熒光信號所達設定閾值時的循環次數即CT值。以β-action為內參，△CT是目的基因(target基因)和內參基因循環閾值的差值。△△CT=干預組(CTtarget-CTβ-action)-對照組(CTtarget-CTβ-action)。目的基因mRNA的相對表達量用2-△△CT方法計算。

2 結 果

2.1 免疫組化Cp的表達 Cp陽性表達主要位于腦出血周邊的膠質細胞，較少表達在神經元細胞及血管內皮細胞(圖1、2見封3)。隨著時間延長，2組Cp表達逐漸增多,于第7天達高峰；第3、7、14 d時，干預組的表達較對照組明顯增多(P<0.05)。見表1。

表1 2組Cp陽性表達細胞計數比較個/HP)

注：與1 d比較，*P<0.05；與3 d比較，#P<0.05；與7 d比較，△P<0.05；與對照組同時點比較，☆P<0.052.2 Cp mRNA表達變化 2組Cp mRNA表達水平高峰均出現在第7天，與對照組相比，干預組大鼠腦組織內CP mRNA 在第1天無統計學差異(P>0.05)，第3、7、14天3個時點的表達均顯著高于對照組，2組比較差異有在統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組Cp mRNA的表達比較

注：與1 d比較，*P<0.05；與3 d比較，#P<0.05；與7 d比較，△P<0.05；與對照組比較，☆P<0.05

3 討 論

ICH后繼發腦損傷與諸多因素有關，其中紅細胞最終降解產物鐵離子在血腫周圍組織濃度異常起主要作用。其中二價鐵可能起關鍵作用；鐵螯合劑的使用可有效減少神經元死亡，提高神經功能恢復能力[5]。但最近研究顯示三價鐵螯合劑——去鐵胺并不能改善大鼠腦出血的預后[6]。

Cp是重要的亞鐵氧化酶，主要在肝臟合成，可在任何鼠類大腦皮質、基底神經節、黑質、海馬、小腦、胼胝體等表達，主要存在于腦毛細血管床周圍膠質細胞。最早認為細胞內的Fe2+首先被轉運到細胞膜上，然后經Cp的作用氧化成Fe3+，進而與細胞外的轉鐵蛋白結合離開細胞膜[7]，Cp的主要作用是通過亞鐵氧化酶的活性實現的，既能影響細胞鐵釋放也能影響細胞鐵攝取，在腦細胞鐵轉運過程中， 后者比前者重要[8]。

Mukhopadhyay等[9]認為如果缺乏Cp可以驅使非鐵蛋白結合的鐵離子(包括抗血酸亞鐵、枸櫞酸或自由的Fe2+)進入神經元或其他中樞神經系統組織細胞中。造成神經元或其他中樞神經系統組織細胞中鐵的過度沉積，誘導氧化應激反應形成自由基，引起一連串的病理變化導致神經元死亡。另外有研究顯示，應用銅藍蛋白能改善腦出血大鼠的運動功能，促進康復，認為在腦內鐵超載的狀態下其主要發揮了鐵釋放的功能[10]。本次試驗顯示在腦出血對照組中，Cp表達逐漸增多，在第7天達高峰，因此推斷可能在生理情況下，Cp主要發揮其鐵攝取功能，在病理狀態下，Cp表達增多，發揮其鐵釋放作用，促進鐵的轉出，從而減輕鐵超載情況下鐵離子對神經細胞的毒性作用。

有研究發現，鐵螯合劑和缺氧能增加外周細胞Cp mRNA的表達[9]。另外有研究認為Cp與鐵調素、膜鐵轉運蛋白輔助蛋白共同對二價鐵轉運膜蛋白(FP1)發揮其鐵轉出的功能起協同作用，共同調節鐵的利用與儲存，同時FP1介導的鐵轉出也依賴Cp的亞鐵氧化酶的活性[11～13]。本實驗顯示在對照組中，第3、7、14天 Cp mRNA的表達逐漸增多。這與以上觀察一致，提示Cp的中樞調控可能和外周的調控機制類似。

Cp作為一個急性期反應蛋白，在臨床許多疾病的診斷檢測及預后判斷上應用廣泛。根據目前研究已明確，Cp在腦內鐵代謝紊亂過程中發揮著重要作用，但是具體的機制尚待進一步的研究。

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Influenceofclioquinolonexperimentalcerebralhemorrhageinratswithceruloplasminexpression

CHENYanli,WANGGaiqing,YINYongfeng,ZHAORui.

DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,ChinaCorrespondingauthor:WANGGaiqing,E-mail:wanggq08@126.com

ObjectiveTo study the effect of clioquinol on the expression of ceruloplasmin in experimental cerebral hemorrhage (ICH) rats.Methods48 Wistar ratSwere randomly divided into 2 groups:control group and the intervention group with each group of 24 rats,using stereotactic injection of collagenase preparation ICH model to the caudate nucleuSof rats,after molding succesSthe intervention group were given clioquinol 50 mg / kg orally every 12 h; intragastric saline control group. From each of 2 groups,six ratSdecapitated at different time pointSafter 1,3,7,14 d,using immunohistochemical staining and real-time PCR detection of Cp.ResultsICH model after preparation ,two groupSwith time Cp positive expression waSsignificantly increased in the first seven daySof the peak; compared with the control group,the intervention group within the brain tissue of ratSin the first Cp day showed no significant difference (P>0.05),the expression at 3-14 d were higher (P<0.05). 2 groups' Cp mRNA expression levelSpeaked at 7 days,and the first 3,7,14 d were higher than the first day expression level (P<0.05). Compared with the control group,the intervention group 3,7,14 day Cp mRNA expression levelSwere higher (P<0.05).ConclusionCQ adjust cerebral hemorrhage by regulating the expression of ceruloplasmin in brain tissue,brain tissue may accelerate the removal of iron ionSand thuSplay a protective role in the brain.

Chloroiodide quinoline; Cerebral hemorrhage; Ceruloplasmin; Rats

山西省高校科技基金項目(No.20091113)；山西醫科大學科技創新基金(No.01201115)

030001 太原，山西醫科大學第二醫院神經內科

王改青， E-mail:wanggq08@126.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.04.020

2013-12-17)