巴西橡膠樹橡膠粒子中2個含RicinB_Lectin_2結構域蛋白質研究初報

摘 要 采用不同提取液，從洗滌過的巴西橡膠樹橡膠粒子中提取蛋白質，并對其進行電泳分離與質譜鑒定。分離鑒定了2個含RicinB_Lectin_2結構域的糖基識別蛋白質，分別命名為HbRBLLP-1和HbRBLLP-2。這2個蛋白質可能是橡膠粒子膜蛋白質或是與橡膠粒子有較強的相互作用的蛋白質。對HbRBLLP-1及HbRBLLP-2進行生物信息學分析，結果表明它們的RicinB_Lectin_2結構域均僅有1個Q-x-W模體，而非蓖麻毒素B鏈所具有的（Q-x-W）3模體。

關鍵詞 巴西橡膠樹 ；橡膠粒子 ；蛋白質 ；RicinB_Lectin_2結構域

分類號 S794.1

Abstract Proteins extracted with different buffers from washed Hevea brasiliensis rubber particles were subjected to electrophoresis and mass spectrometry analysis. Two carbohydrate binding RicinB_Lectin_2 domain containing proteins were isolated and identified， and these two proteins were designated as HbRBLLP-1 and HbRBLLP-2， respectively. These two proteins may be membrane proteins of rubber particles or proteins have a strong interaction with rubber particles. Bioinformatics analysis was also carried out on these two proteins. Bioinformatics analysis showed that HbRBLLP-1 and HbRBLLP-2 have only one QxW motif in their RicinB_Lectin_2 domain， respectively； whereas， ricin B chain has a （QxW）3 motif.

Keywords Hevea brasiliensis ； rubber particles ； protein ； RicinB_Lectin_2 domain

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）幾乎是工業用途天然橡膠的唯一來源[1]。天然橡膠合成的最重要步驟是從異戊二烯焦磷酸多聚化為順式聚異戊二烯的過程，該過程發生于乳管細胞的特定細胞器橡膠粒子的表面[2-3]。橡膠粒子膜結合的橡膠轉移酶或橡膠轉移酶及輔助因子組成的復合體被認為催化了這一過程[1]。然而橡膠轉移酶及其輔助因子未能確定，因此橡膠生物合成的機理至今未能闡明。

為了闡明橡膠生物合成的機理，研究人員進行了分離純化橡膠轉移酶[3-5]及其它橡膠粒子蛋白質的研究。目前，2個最高豐度的橡膠粒子蛋白質得到了分離鑒定：Dennis等[6]報道了橡膠延伸因子（Rubber elongation factor，REF）的氨基酸序列，Oh等[7]報道了小橡膠粒子蛋白（Small rubber particle protein，SRPP）的氨基酸序列。此后，一些REF及SRPP異構體序列信息被提交至NCBI蛋白質數據庫。Zeng等[8]報道了定位于橡膠粒子上的K+依賴的Ⅳ型焦磷酸酶。彭世清等[9]克隆了1個編碼橡膠粒子膜結合的43 ku多聚泛素的基因。代龍軍等[10]利用磺基異硫氰酸苯酯（SPITC）化學輔助質譜從頭測序法鑒定了1個新的REF蛋白異構體，命名為REF2。但關于橡膠粒子蛋白質的報道仍然不夠豐富，橡膠粒子蛋白質的全面鑒定是闡明橡膠生物合成機理及膠乳凝聚機理的重要基礎性研究工作。

最近，本實驗室采用不同的提取液，從洗滌過的橡膠樹橡膠粒子中提取橡膠粒子蛋白質，并且進行16-BAC/SDS PAGE雙向電泳分析[10-11]，采用新公布的基因組及轉錄組測序數據庫[12]進行質譜鑒定，使一些不能從檢索NCBI植物蛋白質庫獲得鑒定的蛋白質得到了鑒定[11]，如醌氧化還原酶、含蓖麻毒素B鏈凝集素結構域蛋白及枯萎/脫水相關蛋白等，其中2個新鑒定的含蓖麻毒素B鏈凝集素（RicinB_Lectin_2）結構域蛋白質命名為HbRBLLP-1及HbRBLLP-2。本研究對為HbRBLLP-1和HbRBLLP-2編碼的基因序列進行了PCR擴增驗證，并對這2個蛋白質進行了生物信息學分1.2 方法

采用不同提取液抽提橡膠粒子蛋白質，并進行雙向電泳分析[10-11]，采用新公布的基因組及轉錄組測序數據庫[12]進行質譜鑒定。蛋白質提取、電泳、質譜鑒定等使用的材料與方法請參見代龍軍等[10-11]的文獻資料。

1.2.1 橡膠樹膠乳總RNA提取

參照曾日中等[13]的方法提取膠乳總RNA。

1.2.2 cDNA第一鏈合成

使用Invitrogen公司3′RACE試劑盒中的反轉錄酶及AP引物參照說明書進行反轉錄獲得cDNA第一鏈。

1.2.3 基因ORF區的擴增

2個新發現的蛋白質點所匹配的橡膠樹轉錄組組裝序列（Transcriptome Shotgun Assembly，TSA），即gi|387086993和gi|387077282已具備完整的ORF，采用Oligo 7軟件從ORF兩側設計引物，如表1所示。基因的擴增采用熱啟動Taq酶，并按Touch down程序[14]進行擴增。PCR產物經凝膠電泳（膠濃度為1%）、切膠回收后連入pMD-18T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，進行菌落PCR篩選陽性克隆，并送往Invitrogen公司進行核酸測序。endprint

2 結果與分析

2.1 2個蛋白質的16-BAC/SDS PAGE及質譜鑒定結果

2種配方提取液抽提蛋白質的16-BAC/SDS PAGE圖譜可分別查閱參考文獻[10]和[11]，HbRbllP-1為文獻[11]圖2中的5號點，HbRbllP-2為文獻[10]圖2中的18號點，質譜鑒定結果如表2所示。2個蛋白質均以遠高于閾值（69分）的得分被鑒定，將2個蛋白質分別命名為HbRBLLP-1（H. brasiliensis ricin B lectin like protein，對應基因的登錄號為gi|387086993）和HbRBLLP-2（對應基因的登錄號為gi|387077282）。

2.2 核酸序列PCR驗證結果

依據從NCBI獲得的核酸序列，使用gi|387086993的1對引物應擴增609 bp的核酸片段，使用gi|387077282的1對引物應擴增1 167 bp的核酸片段。由圖1可知，2個基因的擴增結果與預期的片段長度吻合，測序結果也與從NCBI獲取的TSA序列相吻合。HbRBLLP-1與 HbRBLLP-2的氨基酸序列比對結果見圖2，結果顯示2個蛋白質的氨基酸序列長短不一，序列一致性為49.5%。

2.3 氨基酸序列的生物信息學分析結果

使用ProParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質的理化性質，結果見表3。結果顯示，2個蛋白質具有不同的等電點，HbRBLLP-1呈弱堿性，HbRBLLP-2呈弱酸性。

采用SignalP4.1工具進行蛋白質信號肽序列預測，結果發現HbRBLLP-1與 HbRBLLP-2均無引導蛋白質定位至葉綠體或線粒體的信號肽序列。使用TMHMM Server v2.0工具分析，結果發現2個蛋白質均無跨膜區，然而，對豐度最高的REF（gi|21689593）和SRPP（gi|14423933）進行跨膜區分析，發現這2個蛋白質也無典型的跨膜區[15，7]，但它們是公認的橡膠粒子膜蛋白質。與此形成鮮明對照的是，同樣具有半單位膜結構的油體的結構蛋白—油質蛋白（oleosin）具有2個典型的跨膜結構域。使用PredictProtein工具進行二級結構分析，結果發現，HbRBLLP-1主要包含β折疊和Loop結構，無螺旋結構；HbRBLLP-2主要包含折疊和Loop結構，包含1個僅由5個氨基酸殘基（209～213）構成的α螺旋結構。

使用NCBI的BLASTP工具進行結構域分析，HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2為pfam14200保守結構域蛋白質（ricin-type beta-trefoil lectin domain-like）。pfam14200家族目前包含52個可查詢的蛋白質，其中3個來源于蘑菇的凝集素已確定三級結構：2X2S[16]、2IHO[17]和3NBE[18]。這3個凝集素的活性形式均為相同亞基構成的二聚體，每個亞基含有單一的RicinB lectin結構域，因此只有1個糖結合位點，二聚體凝集素的雙重糖結合位點使之具有凝集活性。其中2X2S、3NBE的RicinB lectin結構域在C端，2IHO的RicinB lectin結構域在N端。

蓖麻毒素B鏈（Ricin B）具有2個同源的Ricnin結構域（每個結構域包含α、β、γ三個同源的長度為40個氨基酸殘基的亞結構域，每個亞結構域都有1個Q-x-W保守結構[19]），2個Ricnin結構域各自包含的（Q-x-W）3模體及糖結合位點；HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2均含有單個RicinB_Lectin_2結構域，且都存在于蛋白質的C端（圖3），但它們的RicinB_Lectin_2結構域均僅有1個Q-x-W模體，而非蓖麻毒素B鏈所具有的（Q-x-W）3模體。

3 討論與結論

3.1 HbRBLLP-1和HbRBLLP-2與橡膠粒子的關系

研究結果發現，分子量較小的HbRBLLP-1比分子量較大的HbRBLLP-2更容易被提取。僅用1% Na2CO3水溶液或更弱的提取液即可將HbRBLLP-1從洗滌過的橡膠粒子中提取[11]；而HbRBLLP-2需用更強的提取液（配方分別見文獻[10]和[11]）抽提。同源蛋白質中分子量較大的蛋白質與橡膠粒子結合更緊密的現象也存在于REF及SRPP異構體中[11]。

橡膠粒子膜為半單位膜結構，橡膠粒子內部為疏水的橡膠烴，蛋白質存在于橡膠粒子膜或橡膠粒子表面。經過3次洗滌，橡膠粒子上仍存在HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2，推測它們是橡膠粒子膜蛋白或與橡膠粒子有較強的相互作用。研究結果表明，橡膠粒子中HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2的豐度均不高，可排除因含量特別高而在橡膠粒子洗滌過程中蛋白質未被溶液充分置換與稀釋的可能。

HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2與橡膠粒子的較強結合，可能與橡膠粒子存在功能上的關聯，這需要進一步的研究予以證實。關于這2個蛋白質是否橡膠粒子膜蛋白質的問題，無法通過TMHMM Server v2.0等工具分析得出簡單的結論。

3.2 HbRBLLP-1和HbRBLLP-2的功能

Ricin超家族蛋白質與酶催化活性、抑制性毒性及信號轉導相關。具有RicinB_Lectin_2結構域的蛋白質是Ricin超家族蛋白質的一個分支，具有糖基識別功能，如凝集素、糖苷酶等。HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2具有RicinB_Lectin_2結構域，因此具有糖基識別功能，但具體功能有待進一步研究。

目前已報道的橡膠樹凝集素有Hevein（4.7 ku），它是膠乳中的一個高豐度蛋白質，是一種抗真菌凝集素[18]，在膠乳凝集中起著重要作用[19]。Wititsuwannakul等[20]發現了1個17 ku的橡膠樹凝集素，也參與膠乳凝集，但未獲得該蛋白質的核酸及蛋白質序列信息。需要從膠乳中純化或進行重組表達HbRBLLP-1和HbRBLLP-2，以獲得足夠的量進行生物活性研究，如凝集實驗等，以探知它們的確切功能。endprint

參考文獻

[1] Cornish K. Biochemistry of natural rubber， a vital raw material， emphasizing biosynthetic rate， molecular weight and compartmentalization，in evolutionarily divergent plant species[J]. Natural Products Reports， 2001， 18（2）： 182-189.

[2] Archer B L， Audley B G， Cockbain E G， et al. The biosynthesis of rubber. Incorporation of mevalonate and isopentenyl pyrophosphate into rubber by Hevea brasiliensis-latex fractions[J]. Biochemical Journal， 1963， 89（3）： 565-574.

[3] McMullen A I， McSweeney G P. The biosynthesis of rubber：Incorporation of isopentenyl pyrophosphate into purified rubber particles by a soluble latex serum enzyme[J]. Biochemical Journal， 1966， 101（1）： 42-47.

[4] Archer B L， Cockbain E G. Rubber transferase from Hevea brasiliensis latex[J]. Methods in Enzymology， 1969， 15： 476-480.

[5] Light D R， Dennis M S. Purification of a prenyltransferase that elongates cis-polyisoprene rubber from the latex of Hevea brasiliensis[J]. Journal of Biological Chemistry，1989，264（31）：18 589-18 597.

[6] Dennis M S， Light D R. Rubber elongation factor from Hevea brasiliensis. Identification，characterization，and role in rubber biosynthesis[J]. Journal of Biological Chemistry， 1989， 264（31）：18 608-18 617.

[7] Oh S K， Kang H， Shin D H， et al. Isolation，characterization， and functional analysis of a novel cDNA clone encoding a small rubber particle protein from Hevea brasiliensis[J]. Journal of Biological Chemistry， 1999， 274（24）： 17 132-17 138.

[8] Zeng R Z，Duan C F，Li X Y，et al. Vacuolar-type inorganic pyrophosphatase located on the rubber particle in the latex is an essential enzyme in regulation of the rubber biosynthesis in Hevea brasiliensis[J]. Plant Science， 2009， 176（5）：602-607.

[9] 彭世清，陳守才. 巴西橡膠樹43 kD橡膠粒子膜蛋白基因的cDNA克隆及表達[J]. 植物生理與分子生物學學報，2004，30（3）：325-330.

[10] 代龍軍，項秋蘭，黎 瑜，等. 巴西橡膠樹橡膠粒子蛋白質的16-BAC/SDS-PAGE雙向電泳及質譜分析[J]. 中國農業科學，2012，45（11）：2 328-2 338.

[11] 代龍軍，黎 瑜，聶智毅，等. 不同提取液對巴西橡膠樹橡膠粒子蛋白質提取和分離的影響[J]. 植物生理學報，2013，49（10）：1 089-1 098.

[12] Rahman A Y A， Usharraj A O， Misra B B， et al. Draft genome sequence of the rubber tree Hevea brasiliensis[J]. BMC genomics， 2013， 14（1）： 75.

[13] 曾日中，段翠芳，黎 瑜，等. 茉莉酸刺激的橡膠樹膠乳cDNA消減文庫的構建及其序列分析[J]. 熱帶作物學報，2003，24（3）：1-6.

[14] Roux K. Single-step PCR optimization using touchdown and stepdown PCR programming[J]. Methods in Molecular Biology， 2002， 192： 31-36.

[15] Dennis M， Henzel W， Bell J， et al. Amino acid sequence of rubber elongation factor protein associated with rubber particles in Hevea latex[J]. Journal of Biological Chemistry， 1989， 264（31）： 18 618-18 626.endprint

[16] Sulzenbacher G， Roig-Zamboni V， Peumans W J， et al. Crystal structure of the GalNAc/Gal-specific agglutinin from the phytopathogenic ascomycete Sclerotinia sclerotiorum reveals novel adaptation of a beta-trefoil domain[J]. Journal of Molecular Biology， 2010， 400（4）： 715-723.

[17] Grahn E， Askarieh G， Holmner A， et al. Crystal Structure of the Marasmius Oreades mushroom lectin in complex with a Xenotransplantation epitope[J]. Journal of Molecular Biology， 2007， 369（3）： 710-721.

[18] Pohleven J， Renko M， Magister S， et al. Bivalent carbohydrate binding is required for biological activity of Clitocybe nebularis lectin（CNL）， the N，N'-diacetyllactosediamine （GalNAcbeta1-4GlcNAc，LacdiNAc）-specific lectin from basidiomycete C. nebularis[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2012， 287（13）： 10 602-10 612.

[19] Rutenber E， Ready M， Robertus J D. Structure and evolution of ricin B chain[J]. Nature， 1987， 326（4）： 624-626.

[20] Parijs J， Broekaert W F， Goldstein I J， et al. Hevein：an antifungal protein from rubber-tree （Hevea brasiliensis）latex[J]. Planta， 1991， 183（2）：258-264.

[21] Gidrol X， Chrestin H， Tan H L， et al. Hevein，a lectin-like protein from Hevea brasiliensis （rubber tree）is involved in the coagulation of latex[J]. Journal of Biological Chemistry， 1994， 269（12）： 9 278-9 283.

[22] Wititsuwannakul R， Pasitkul P， Kanokwiroon K， et al. A role for a Hevea latex lectin-like protein in mediating rubber particle aggregation and latex coagulation[J]. Phytochemistry， 2008， 69（2）： 339-347.endprint

[16] Sulzenbacher G， Roig-Zamboni V， Peumans W J， et al. Crystal structure of the GalNAc/Gal-specific agglutinin from the phytopathogenic ascomycete Sclerotinia sclerotiorum reveals novel adaptation of a beta-trefoil domain[J]. Journal of Molecular Biology， 2010， 400（4）： 715-723.

[17] Grahn E， Askarieh G， Holmner A， et al. Crystal Structure of the Marasmius Oreades mushroom lectin in complex with a Xenotransplantation epitope[J]. Journal of Molecular Biology， 2007， 369（3）： 710-721.

[18] Pohleven J， Renko M， Magister S， et al. Bivalent carbohydrate binding is required for biological activity of Clitocybe nebularis lectin（CNL）， the N，N'-diacetyllactosediamine （GalNAcbeta1-4GlcNAc，LacdiNAc）-specific lectin from basidiomycete C. nebularis[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2012， 287（13）： 10 602-10 612.

[19] Rutenber E， Ready M， Robertus J D. Structure and evolution of ricin B chain[J]. Nature， 1987， 326（4）： 624-626.

[20] Parijs J， Broekaert W F， Goldstein I J， et al. Hevein：an antifungal protein from rubber-tree （Hevea brasiliensis）latex[J]. Planta， 1991， 183（2）：258-264.

[21] Gidrol X， Chrestin H， Tan H L， et al. Hevein，a lectin-like protein from Hevea brasiliensis （rubber tree）is involved in the coagulation of latex[J]. Journal of Biological Chemistry， 1994， 269（12）： 9 278-9 283.

[22] Wititsuwannakul R， Pasitkul P， Kanokwiroon K， et al. A role for a Hevea latex lectin-like protein in mediating rubber particle aggregation and latex coagulation[J]. Phytochemistry， 2008， 69（2）： 339-347.endprint

[16] Sulzenbacher G， Roig-Zamboni V， Peumans W J， et al. Crystal structure of the GalNAc/Gal-specific agglutinin from the phytopathogenic ascomycete Sclerotinia sclerotiorum reveals novel adaptation of a beta-trefoil domain[J]. Journal of Molecular Biology， 2010， 400（4）： 715-723.

[17] Grahn E， Askarieh G， Holmner A， et al. Crystal Structure of the Marasmius Oreades mushroom lectin in complex with a Xenotransplantation epitope[J]. Journal of Molecular Biology， 2007， 369（3）： 710-721.

[18] Pohleven J， Renko M， Magister S， et al. Bivalent carbohydrate binding is required for biological activity of Clitocybe nebularis lectin（CNL）， the N，N'-diacetyllactosediamine （GalNAcbeta1-4GlcNAc，LacdiNAc）-specific lectin from basidiomycete C. nebularis[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2012， 287（13）： 10 602-10 612.

[19] Rutenber E， Ready M， Robertus J D. Structure and evolution of ricin B chain[J]. Nature， 1987， 326（4）： 624-626.

[20] Parijs J， Broekaert W F， Goldstein I J， et al. Hevein：an antifungal protein from rubber-tree （Hevea brasiliensis）latex[J]. Planta， 1991， 183（2）：258-264.

[21] Gidrol X， Chrestin H， Tan H L， et al. Hevein，a lectin-like protein from Hevea brasiliensis （rubber tree）is involved in the coagulation of latex[J]. Journal of Biological Chemistry， 1994， 269（12）： 9 278-9 283.

[22] Wititsuwannakul R， Pasitkul P， Kanokwiroon K， et al. A role for a Hevea latex lectin-like protein in mediating rubber particle aggregation and latex coagulation[J]. Phytochemistry， 2008， 69（2）： 339-347.endprint