幾株尖孢鐮刀菌的綠色熒光蛋白基因轉化

黃東杰等

摘 要 利用PEG介導的原生質體轉化方法，將綠色熒光蛋白基因轉入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。結果表明：轉化子連續轉接5代能夠穩定遺傳，熒光強度良好，PCR驗證gfp基因已轉入到菌株中，為后續研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可視化的檢測和分析手段。

關鍵詞 尖孢鐮刀菌古巴?；?；尖孢鐮刀菌萎蔫專化型 ；綠色熒光蛋白 ；原生質體轉化

分類號 Q78

Abstract Several Fusarium oxysporum strains （Foc1， Foc4， Foc 8359#， Foc 8361#， Foc 8363#， Foc 8368# and Fov） have been successfully transformed with the gene coding for green fluorescent protein （GFP） using protoplast transformation method mediated by PEG. Transformants can emit quite stable fluorescence under 480 nm laser after five successive subcultures. PCR analysis confirmed that the gfp gene had been transformed into F. oxysporum strains. Those GFP transformations of F. oxysporum will provide a visible material for the study of infection and control of fusarium wilt of banana and cotton.

Keywords Fusarium oxysporum f. sp. Cubence ； Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum ； green fluorescent protein ； protoplast transformation

香蕉枯萎病又稱巴拿馬病、黃葉病，是由半知菌亞門絲孢綱瘤座孢目鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubence， Foc）引起的土傳維管束病害[1]。2007年5月中國將香蕉枯萎病列入進境植物檢疫性有害生物名錄[2]。目前發現該病菌有4個生理小種，其中，4號小種危害最大，是目前香蕉病害中最難防治的病害，危害大蜜哈（AAA）、香牙蕉（AAA）、Taiwan Latundan（AAB）、Pisang Lilin（AA）、野蕉（BB）和Silk（AAB）等[3]。

棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌萎蔫?；停‵usarium oxysporum f. sp. vasinfectum， Fov） 引起的棉花土傳維管束病害，是一種對棉花危害性較大的病害，同時也是一種世界性棉花病害，在中國湖北、新疆棉區發生較普遍，發病嚴重的田塊，可以造成毀滅性的損失。發病植株葉片發黃或呈現紫外線斑，葉脈也變成紫紅色；有的病株葉脈變黃成為網狀；病株在雨后初晴時出現急性病癥，全株萎蔫下垂枯死，或整株半邊葉子變黃，并逐漸枯萎脫落成光稈而死。無論哪種癥狀類型，剖開棉株莖稈，輸導組織都變為深褐色[4]。

綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）自1962年從發光水母（A. victoria）中被發現以來，已作為報告基因被廣泛應用[5]。GFP本身即為發光蛋白，熒光性穩定、直觀，操作方便，不添加任何外源底物就可以在活體細胞中觀察和進行定位檢測，彌補了傳統報告基因的不足。本文利用攜帶gfp基因的pCT74質粒，采用PEG介導的原生質體轉化方法，轉化6株來自不同地區的香蕉枯萎病菌（Foc）和1株棉花枯萎病菌（Fov）。香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌均為尖孢鐮刀菌，均危害宿主維管束，為便于今后研究尖孢鐮刀菌的共性致病機制，對它們同時進行GFP標記。6株香蕉枯萎病菌來自不同的國家和地區，或屬于不同生理小種，對它們同時進行GFP標記有助于今后進行致病力差異研究。本研究將為后續枯萎病菌侵染機理和宿主抗病機理的研究提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

香蕉枯萎病菌（尖孢鐮刀菌古巴專化型，Fusarium oxysporum f. sp. cubence， Foc） Foc1、Foc4及（Fov）由本實驗室保存；Foc 8359# （澳大利亞）、Foc 8361#（澳大利亞）、Foc 8363#（馬來西亞）、Foc 8368# （臺灣）來自香港浸會大學。

pCT74質粒，由福建省農業科學院農業生物資源研究所農業微生物研究中心肖榮鳳惠贈，含有真菌P.triticirepentis的ToxA啟動子和潮霉素B磷酸轉移酶基因（hygr）[6]。

1.2 方法

1.2.1 質粒提取

質粒DNA提取按Plasmid Mini Kit（QIAGEN）試劑盒說明書進行。

1.2.2 原生質體制備

參照肖榮鳳等[6]的方法，略做調整。具體如下：① 從培養皿上挑取少量菌絲于盛有100 mL PDB培養基的250 mL三角瓶中，28或30℃，180 r/min，振蕩培養48 h。然后用3層擦鏡紙過濾，獲得孢子懸液，濃度約107 spores/mL。② 吸取1～2 mL孢子懸液到含100 mL PDB培養基的三角瓶中，28℃，150 r/min，振蕩培養12 h。③ 以3層擦鏡紙過濾，收集菌絲，再用2 mL NaCl溶液洗滌3次。④ 將菌絲置于50 mL離心管中，加入裂解液（每克菌絲加約3.5 mL），28℃，70 r/min振蕩消化3 h。⑤ 以3層擦鏡紙過濾，將濾液室溫5 000 r/min離心10 min；棄上清，加40 mL STC溶液，5 000 r/min離心10 min。⑥ 棄上清，沉淀用適量STC溶液（200～400 μL）溶解[（原生質體濃度約為（1-9）×107 spores/mL）]。endprint

1.2.3 原生質體的轉化

參照肖榮鳳等[6]的方法，略做調整。具體如下：于200 μL原生質溶液中加40 μL pCT74質粒DNA（約2～5 μg），輕搖混勻，室溫放置20 min；滴加1.25 mL PTC溶液，邊加邊搖，室溫放置20 min；加到100 mL冷卻至40～50℃的半固體再生培養基中（含50 μg/mL Amp 和200 μg/mL HmB），混勻，倒入底層已有半固體再生培養基的培養皿上；28℃，倒置培養，7～10 d后可獲得轉化子。

1.2.4 轉化子的熒光穩定性分析及PCR檢測

挑取半固體再生培養基上長出的轉化子的少量菌絲在熒光共聚焦顯微鏡480 nm激發光下觀察檢測，以可見光下的觀察作為對照。將能夠觀察到綠色熒光的轉化子繼代培養5代后，進行熒光穩定性分析和菌落PCR檢測。先將少量菌絲用液氮碾磨，加入適量CTAB裂解液，65℃水浴10 min，離心，取上清作模板[7]。PCR反應程序：94℃ 3 min；94℃ 45 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 10 min。PCR產物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，以凝膠圖像分析系統觀察。

2.2 轉化子熒光穩定性分析

將在激光共聚焦顯微鏡480 nm激發光下發綠色熒光的轉化子在無篩選壓力的培養基平板上繼代5次后，在含200 μg/mL HmB的PDA上生長良好，顯微觀察到菌絲和孢子均發出強烈的綠色熒光（圖2），說明這些轉化子gfp基因已被轉入到菌株中，性狀穩定。

2.3 轉化子PCR檢測

對繼代5次的轉化子基因組DNA進行PCR擴增包含325 bp的啟動子序列和90 bp的 ToxA基因5′端非翻譯區[8]，進一步說明該gfp基因已經轉入到菌株中，并具良好的穩定性。

3 討論與結論

GFP被廣泛應用于絲狀真菌研究，可作為報告基因進行定位及定性檢測，此外在細胞動力學、突變體致病力、蛋白表達、真菌與宿主相互作用、真菌環境生態學等研究中均有應用[9]。本研究中獲得的轉化菌株在含200 μg/mL HmB的PDA上繼代5次后，其菌絲及孢子均能發出極強的綠色熒光，說明gfp基因已經成功轉入到菌株中，同時繼代5次后的轉化子也能經過PCR檢測到gfp基因片段。

原生質體的制備是轉化成功的關鍵[10]，利用孢子懸浮液培養12 h，得到的菌絲均為幼潤的新鮮菌絲，且新鮮程度相對一致，易于原生質體的制備，與肖榮鳳等[6]結果一致。由于尖孢鐮刀菌為尖端生長方式，菌絲尖端最幼嫩，易被酶解。本研究成功地將gfp基因轉入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中，且轉化子具備較好的穩定性。本研究所獲得的轉化菌株將被應用于香蕉和棉花的侵染、防治等研究中，為其提供可視化的檢測和分析手段。

致 謝 感謝福建省農業科學院農業生物資源研究所農業微生物研究中心肖榮鳳轉贈pCT74質粒及其在菌株轉化方面提供的幫助。

參考文獻

[1] Wardlaw C W. The biology of banana wilt（Panama disease）.lll. An examination of sucker infection though Root-bases[D]. Trinldad.B.W.I： The doetoral dissertation of Imperial College of Tropical Agriculture， 1931： 383.

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[7] 周禮紅，李國琴，王正祥，等. 紅曲霉原生質體的制備、再生及其遺傳轉化系統[J]. 遺傳，2005，27（3）：423-428.

[8] Lorang J M， Tuori R P， Martinez J P， et al. Green fluorescent protein is lighting up fungal biology[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（5）： 1 987-1 994.

[9] 徐 瑩，劉太國，何月秋，等. 綠色熒光蛋白及其在絲狀真菌研究中的應用[J]. 植物保護，2008，34（6）：1-6.

[10] 王淑民. 棉花枯萎病[J]. 中國棉花，1995（3）：37.endprint

1.2.3 原生質體的轉化

參照肖榮鳳等[6]的方法，略做調整。具體如下：于200 μL原生質溶液中加40 μL pCT74質粒DNA（約2～5 μg），輕搖混勻，室溫放置20 min；滴加1.25 mL PTC溶液，邊加邊搖，室溫放置20 min；加到100 mL冷卻至40～50℃的半固體再生培養基中（含50 μg/mL Amp 和200 μg/mL HmB），混勻，倒入底層已有半固體再生培養基的培養皿上；28℃，倒置培養，7～10 d后可獲得轉化子。

1.2.4 轉化子的熒光穩定性分析及PCR檢測

挑取半固體再生培養基上長出的轉化子的少量菌絲在熒光共聚焦顯微鏡480 nm激發光下觀察檢測，以可見光下的觀察作為對照。將能夠觀察到綠色熒光的轉化子繼代培養5代后，進行熒光穩定性分析和菌落PCR檢測。先將少量菌絲用液氮碾磨，加入適量CTAB裂解液，65℃水浴10 min，離心，取上清作模板[7]。PCR反應程序：94℃ 3 min；94℃ 45 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 10 min。PCR產物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，以凝膠圖像分析系統觀察。

2.2 轉化子熒光穩定性分析

將在激光共聚焦顯微鏡480 nm激發光下發綠色熒光的轉化子在無篩選壓力的培養基平板上繼代5次后，在含200 μg/mL HmB的PDA上生長良好，顯微觀察到菌絲和孢子均發出強烈的綠色熒光（圖2），說明這些轉化子gfp基因已被轉入到菌株中，性狀穩定。

2.3 轉化子PCR檢測

對繼代5次的轉化子基因組DNA進行PCR擴增包含325 bp的啟動子序列和90 bp的 ToxA基因5′端非翻譯區[8]，進一步說明該gfp基因已經轉入到菌株中，并具良好的穩定性。

3 討論與結論

GFP被廣泛應用于絲狀真菌研究，可作為報告基因進行定位及定性檢測，此外在細胞動力學、突變體致病力、蛋白表達、真菌與宿主相互作用、真菌環境生態學等研究中均有應用[9]。本研究中獲得的轉化菌株在含200 μg/mL HmB的PDA上繼代5次后，其菌絲及孢子均能發出極強的綠色熒光，說明gfp基因已經成功轉入到菌株中，同時繼代5次后的轉化子也能經過PCR檢測到gfp基因片段。

原生質體的制備是轉化成功的關鍵[10]，利用孢子懸浮液培養12 h，得到的菌絲均為幼潤的新鮮菌絲，且新鮮程度相對一致，易于原生質體的制備，與肖榮鳳等[6]結果一致。由于尖孢鐮刀菌為尖端生長方式，菌絲尖端最幼嫩，易被酶解。本研究成功地將gfp基因轉入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中，且轉化子具備較好的穩定性。本研究所獲得的轉化菌株將被應用于香蕉和棉花的侵染、防治等研究中，為其提供可視化的檢測和分析手段。

致 謝 感謝福建省農業科學院農業生物資源研究所農業微生物研究中心肖榮鳳轉贈pCT74質粒及其在菌株轉化方面提供的幫助。

參考文獻

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[10] 王淑民. 棉花枯萎病[J]. 中國棉花，1995（3）：37.endprint

1.2.3 原生質體的轉化

參照肖榮鳳等[6]的方法，略做調整。具體如下：于200 μL原生質溶液中加40 μL pCT74質粒DNA（約2～5 μg），輕搖混勻，室溫放置20 min；滴加1.25 mL PTC溶液，邊加邊搖，室溫放置20 min；加到100 mL冷卻至40～50℃的半固體再生培養基中（含50 μg/mL Amp 和200 μg/mL HmB），混勻，倒入底層已有半固體再生培養基的培養皿上；28℃，倒置培養，7～10 d后可獲得轉化子。

1.2.4 轉化子的熒光穩定性分析及PCR檢測

挑取半固體再生培養基上長出的轉化子的少量菌絲在熒光共聚焦顯微鏡480 nm激發光下觀察檢測，以可見光下的觀察作為對照。將能夠觀察到綠色熒光的轉化子繼代培養5代后，進行熒光穩定性分析和菌落PCR檢測。先將少量菌絲用液氮碾磨，加入適量CTAB裂解液，65℃水浴10 min，離心，取上清作模板[7]。PCR反應程序：94℃ 3 min；94℃ 45 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 10 min。PCR產物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，以凝膠圖像分析系統觀察。

2.2 轉化子熒光穩定性分析

將在激光共聚焦顯微鏡480 nm激發光下發綠色熒光的轉化子在無篩選壓力的培養基平板上繼代5次后，在含200 μg/mL HmB的PDA上生長良好，顯微觀察到菌絲和孢子均發出強烈的綠色熒光（圖2），說明這些轉化子gfp基因已被轉入到菌株中，性狀穩定。

2.3 轉化子PCR檢測

對繼代5次的轉化子基因組DNA進行PCR擴增包含325 bp的啟動子序列和90 bp的 ToxA基因5′端非翻譯區[8]，進一步說明該gfp基因已經轉入到菌株中，并具良好的穩定性。

3 討論與結論

GFP被廣泛應用于絲狀真菌研究，可作為報告基因進行定位及定性檢測，此外在細胞動力學、突變體致病力、蛋白表達、真菌與宿主相互作用、真菌環境生態學等研究中均有應用[9]。本研究中獲得的轉化菌株在含200 μg/mL HmB的PDA上繼代5次后，其菌絲及孢子均能發出極強的綠色熒光，說明gfp基因已經成功轉入到菌株中，同時繼代5次后的轉化子也能經過PCR檢測到gfp基因片段。

原生質體的制備是轉化成功的關鍵[10]，利用孢子懸浮液培養12 h，得到的菌絲均為幼潤的新鮮菌絲，且新鮮程度相對一致，易于原生質體的制備，與肖榮鳳等[6]結果一致。由于尖孢鐮刀菌為尖端生長方式，菌絲尖端最幼嫩，易被酶解。本研究成功地將gfp基因轉入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中，且轉化子具備較好的穩定性。本研究所獲得的轉化菌株將被應用于香蕉和棉花的侵染、防治等研究中，為其提供可視化的檢測和分析手段。

致 謝 感謝福建省農業科學院農業生物資源研究所農業微生物研究中心肖榮鳳轉贈pCT74質粒及其在菌株轉化方面提供的幫助。

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[6] 李春強，梁慧施，夏亦薺，等. GFP標記的尖孢鐮刀菌西瓜?；颓秩疚鞴线^程觀察[J]. 熱帶作物學報，2011，32（10）：1 935-1 939.

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[9] 徐 瑩，劉太國，何月秋，等. 綠色熒光蛋白及其在絲狀真菌研究中的應用[J]. 植物保護，2008，34（6）：1-6.

[10] 王淑民. 棉花枯萎病[J]. 中國棉花，1995（3）：37.endprint