巴西橡膠樹HbUBC14基因克隆、生物信息學及表達分析

2014-08-12 19:04:15李德軍鄧治劉向紅劉輝

熱帶農業科學 2014年5期

李德軍　鄧治　劉向紅　劉輝

摘要從巴西橡膠樹中鑒定出一個泛素結合酶（UBC）基因，該基因長653 bp，最長開放閱讀框504 bp，預測編碼蛋白包含167個氨基酸；序列比對分析發現，該基因編碼的蛋白具有一段保守的UBC結構域，與擬南芥E2成員UBC14（At3g55380）具有較高的相似性，故將該基因命名為HbUBC14。半定量RT-PCR分析結果表明，HbUBC14在巴西橡膠樹膠乳中表達最高，在花藥中表達最低。與健康橡膠樹相比，死皮樹膠乳中HbUBC14表達量明顯下降。HbUBC14表達還受乙烯和茉莉酸調控。以上結果表明，HbUBC14可能在巴西橡膠樹死皮、乙烯和茉莉酸反應中發揮作用。

關鍵詞巴西橡膠樹；HbUBC14 ；表達分析

分類號 S794.1

泛素/26S蛋白酶體途徑（Ubiquitin/26S Proteasome Pathway，UPP）是生物體內最重要且高效的選擇性降解蛋白質途徑，對生物體維持正常生命活動至關重要。UPP主要由泛素激活酶（ubiquitin activating enzyme，E1）、泛素結合酶（ubiquitin conjugating enzyme，UBC/E2）、泛素蛋白連接酶（ubiquitin-protein ligase，E3）和26S蛋白酶體組成。在UPP中，泛素（Ubiquitin，Ub）是一個可被重復利用識別靶蛋白的信號，Ub聚合體通過三步酶接合級聯反應與靶蛋白共價結合，最終導致靶蛋白被26 S蛋白酶體降解為較小的多肽、氨基酸，同時可被重復利用的Ub釋放出來[1]。作為高效、專一性和選擇性強的蛋白降解途徑，UPP幾乎涉及植物發育機制的所有方面，其核心是激素反應，包括激素合成、感知和下游信號傳導[2-5]。

E2是催化泛素與底物蛋白結合的第二個酶，在UPP酶接合級聯反應中E2發揮著橋梁和紐帶的作用。E2在UBC結構域內含有一個高度保守的半胱氨酸（cysteine）位點，接受從E1泛素復合物轉移過來的活化泛素分子后，形成E2-Ub復合物。在E3的協同作用下，E2-Ub復合物把活化的泛素分子轉移到底物蛋白上，形成單泛素化或多聚泛素化蛋白，具有泛素標記的蛋白最終被26S蛋白酶體降解[6]。研究表明，E2在DNA修復、植物生長發育和脅迫應答等方面均發揮重要作用。真核生物復制后DNA修復主要由RAD6和RAD18控制，在以RAD6為中心的復制后DNA修復途徑中，傷害誘導的PCNA泛素化是DNA修復的前提，而PCNA不同修飾則影響對DNA損傷的抗性[7-8]。DNA損傷誘導染色質相關蛋白磷酸化使RNF8和UBC13聚集到DNA損傷位點，RNF8-UBCl3復合物可獨立完成泛素化，進而促RAP80和完整的Brcal A復合物在DNA損傷位點募集完成DNA修復[9-10]。在擬南芥基因組中至少存在37個E2基因，E2可部分決定蛋白泛素化效率和特異性[11]。AtUBC1、AtUBC2和AtUBC3與酵母RAD6基因同源，AtUBC2可互補酵母rad6突變體。AtUBC1和AtUBC2能通過上調擬南芥開花基因（FLC）表達抑制開花，AtUBC3則不參與開花過程的調控[12-14]。擬南芥類E2蛋白—COP10無E2活性，但可通過提高一些E2蛋白活性調控植物的的生長發育過程，UBC19和UBC20除參與分化細胞泛素化反應外，還在細胞周期中發揮關鍵作用[15-16]。除與DNA修復和植物生長發育相關，E2還在脅迫應答中發揮重要作用。徐晨曦等[17]從耐鹽灌木檉柳中獲得了一個E2基因，在煙草中異源表達E2基因證明，該基因能提高轉基因煙草的耐旱性。Cui等[18]研究發現，擬南芥UBC32在油菜素內酯介導的植物生長和耐鹽反應中發揮作用。

巴西橡膠樹是一種重要的熱帶經濟林木，它產生的膠乳是天然橡膠的主要原料。中國天然橡膠供需矛盾日益凸顯，目前自給率已降至20%以下。中國植膠區域有限，因此提高單產是保障我國天然橡膠供給能力的唯一出路。在影響天然橡膠單產的因素中，橡膠樹死皮是主要限制因子之一。Chua[19]研究發現，死皮橡膠樹中可溶性蛋白質含量低于健康橡膠樹，說明橡膠樹死皮發生過程中蛋白質代謝以降解代謝為主。范思偉和楊少瓊[20]研究發現，死皮發生發展過程中膠乳組織蛋白酶活性增加，表明乳管細胞蛋白分解代謝增強。Li等[21]進一步研究表明，UPP為橡膠樹死皮發生關鍵調控途徑之一。盡管以上研究表明，UPP在橡膠樹在死皮中發揮重要作用，但有關UPP在橡膠樹中的研究報道較少。本研究從巴西橡膠樹中克隆了一個UBC基因—HbUBC14，對該基因進行了生物信息學及在不同組織、死皮和健康橡膠樹膠乳、乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）處理條件下的表達模式分析，以期為進一步揭示HbUBC14的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以優良巴西橡膠樹品系熱研7-33-97為實驗材料，該材料于1990年定植于中國熱帶農業科學院試驗農場五隊，采用4 d 1刀、1/2螺旋割線加1.5%乙烯利刺激割膠，其中死皮樹選用割面不排膠長度為2 cm至1/4割線間的橡膠樹。不同組織及健康和死皮橡膠樹膠乳均來源于上述材料；ET（乙烯利）和JA（茉莉酸）處理參考Hao和Wu[22]的方法進行，ET和JA的處理濃度分別為1%和0.3%。ET和JA處理植株為2003年定植于中國熱帶農業科學院試驗農場七隊的未開割幼樹，以不作任何處理的幼樹為對照，采集處理后0、4、8、24、48、72和120 h（只取ET處理樣品）的膠乳。

1.2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

根據Xu等[23]的方法提取樹皮、膠乳、葉片、花等組織總RNA，用DNase I處理去除RNA中殘留的少量DNA。cDNA第一鏈合成按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit說明書提供的方法和步驟進行。endprint

1.3 HbUBC14克隆及生物信息學分析

根據橡膠樹已知基因片段（TSA：JR349640.1和JT967526.1）拼接序列設計引物HbUBC14F和HbUBC14R（表1），用PyrobestTM DNA酶進行PCR擴增并測序擴增產物以驗證基因序列。擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸7 min。擴增產物回收后連接到pMD18-T載體，挑取陽性克隆送公司測序。

利用DNAstar 7.0查找序列開放閱讀框并翻譯成蛋白的分子量和等電點。利用在線NCBI保守結構域數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析HbUBC14蛋白保守結構域、活性部位、硫酯中間體互作殘基和E3互作殘基。

1.4 HbUBC14表達分析

根據HbUBC14基因序列設計特異引物HbUBC14-RTF和HbUBC14-RTR（表1），以橡膠樹18S RNA基因作為內參，采用半定量PCR分析HbUBC14在巴西橡膠樹不同組織、死皮和健康橡膠樹膠乳及ET和JA處理條件下的表達模式。半定量PCR擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸35 s，30～35個循環；72℃延伸7 min，擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，然后用凝膠成像儀掃描膠圖。

2 結果與分析

2.1 HbUBC14克隆及序列分析

在分析健康橡膠樹樹皮轉錄組測序數據時發現，2個基因片段（TSA：JR349640.1和JT967526.1）與UBC高度相似[24-25]。通過組裝2個基因片段獲得長653 bp基因，為驗證拼接序列，在基因兩端設計引物HbUBC14F和HbUBC14R并進行PCR擴增，回收PCR擴增產物，連接pMD18-T載體并測序。測序結果表明，該基因長653 bp，最長開放閱讀框504 bp（圖1）；以獲得基因為查詢序列，在NCBI網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.org）進行BLASTX比對，發現該預測蛋白具有一段高度保守的UBC結構域，與擬南芥At3g55380蛋白高度相似，而At3g55380蛋白為擬南芥E2成員UBC14，因此，將從巴西橡膠樹中得到的基因命名為HbUBC14。

2.2 HbUBC14生物信息學分析

HbUBC14蛋白包含167個氨基酸，預測分子量為18.66 ku，等電點為5.128。以HbUBC14氨基酸為查詢序列，利用NCBI網站在線保守結構域數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測HbUBC14蛋白保守結構域。從第9到第160位氨基酸為保守的UBC結構域區。此外，HbUBC14還預測到1個活性半胱氨酸位點（第90位）、21個泛素硫酯中間體互作殘基和5個E3互作殘基（圖1）。UBC結構域及上述特征對HbUBC14行使E2功能至關重要。

2.3 HbUBC14在不同組織及死皮和健康橡膠樹膠乳中的表達分析

以Hb18S rRNA為內參，利用半定量RT-PCR方法分析HbUBC14在不同組織及死皮和健康橡膠樹膠乳中的表達模式。結果表明，HbUBC14在巴西橡膠樹膠乳中高表達，接下來是葉片、雌花、雄花、樹皮和花藥（圖2A）。如圖2B所示，與健康橡膠樹膠乳相比，HbUBC14在死皮橡膠樹膠乳中表達量明顯下降。

2.4 HbUBC14在乙烯和茉莉酸處理條件下的表達模式分析

HbUBC14在乙烯和茉莉酸處理條件下的表達模式分析如圖3所示。ET和JA處理均能調控HbUBC14基因表達。在ET處理下，HbUBC14表達在8 h開始上升，24 h達最大值，之后開始下降，72和120 h基本維持在8h表達水平（圖3A）。與ET處理不同，JA處理后HbUBC14表達量持續增加，處理4和8 h 時有所上升，24 h表達量明顯增加，72 h表達量達到最大值（圖3B）。

3 討論

E2是UPP的一個重要成員，在UPP酶接合級聯反應中起到橋梁和紐帶的作用[6]。本研究克隆了1個橡膠樹E2成員—HbUBC14，生物信息學分析表明，HbUBC14同其它生物E2蛋白一樣，含有高度保守的UBC結構域、半胱氨酸活性位點、泛素硫酯中間體互作殘基和E3互作殘基，根據以上特征推測HbUBC14可行使E2蛋白功能。序列比對發現，HbUBC14與擬南芥AtUBC14相似性最高，但AtUBC14功能仍不清楚，因此不能通過AtUBC14推測HbUBC14功能[26]。本研究發現HbUBC14表達無組織特異性，但在膠乳中高表達，說明HbUBC14可能在橡膠樹膠乳生物合成和代謝中具有重要作用。與健康橡膠樹相比，死皮橡膠樹中可溶性蛋白質含量顯著低于健康橡膠樹，死皮發生發展過程中膠乳組織蛋白酶活性增加，說明乳管細胞蛋白分解代謝增強[19-20]。Li等[21]研究發現，死皮相關基因在UPP途徑中富集，提出UPP是橡膠樹死皮發生關鍵調控途徑。UPP是高度選擇性的蛋白降解途徑，E2作為UPP途徑中的關鍵成員必然在蛋白選擇性降解中發揮重要作用。RT-PCR分析結果表明，HbUBC14在健康橡膠樹膠乳中高表達，而在死皮橡膠樹膠乳中基本無表達，其是否與死皮橡膠樹蛋白含量低相關，還需要進一步實驗驗證。

在橡膠樹中，對ET和JA兩個激素的研究和應用較為深入。ET作為橡膠樹增產刺激劑，通過延長排膠時間提高橡膠產量[27]，而過度割膠和強乙烯利刺激容易誘發橡膠樹死皮[20]；JA能誘導橡膠樹乳管分化，乳管分化能力和數目多少是橡膠樹是否高產的一個重要標志[22]。本研究結果表明，ET和JA可調控HbUBC14表達，因此可能與ET和JA信號轉導相關。綜合本研究結果，推測HbUBC14為多功能基因，可能參與橡膠樹死皮、ET和JA信號轉導、膠乳再生和乳管分化等過程。HbUBC14基因克隆、生物信息學及表達分析為進一步研究HbUBC14在橡膠樹中的生物學功能奠定了基礎。endprint

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