經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)前他汀再負(fù)荷對(duì)圍術(shù)期循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞及炎癥因子的影響

賀甫威， 葉紅華， 費(fèi)曉紅， 樓燕如， 王世奇， 楊 銳， 胡燁文， 陳曉敏

(寧波市第一醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 寧波 315010)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，由骨髓動(dòng)員到外周血中。它們具有一定的擴(kuò)增能力及分化潛能，在胚胎期參與血管的形成，出生后可參與受損血管的修復(fù)[1-2]。冠心病的本質(zhì)上是一種血管疾病，由于內(nèi)皮祖細(xì)胞參與血管內(nèi)皮修復(fù)，因此在冠心病發(fā)生發(fā)展中循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的缺乏可能起到重要作用[3]。他汀類藥物也稱3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成早期過程中限速酶的活性，繼而上調(diào)細(xì)胞表面低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)受體，加速血漿LDL的分解代謝，降低血漿中LDL；此外，還具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抑制血小板聚集、抗炎及穩(wěn)定斑塊的作用[4-7]；在臨床上已被廣泛應(yīng)用于抗動(dòng)脈粥樣硬化。近年來，以ARMYDA系列研究為代表的他汀類藥物對(duì)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)圍術(shù)期干預(yù)的相關(guān)研究提示術(shù)前強(qiáng)化他汀負(fù)荷治療或長(zhǎng)期服用他汀治療的患者術(shù)前再負(fù)荷可顯著降低圍術(shù)期心梗等主要心血管不良事件[8]。然而在不同的研究中他汀再負(fù)荷的方案大不相同，同時(shí)不同他汀的負(fù)荷方案對(duì)他汀多效性影響的研究較少。因此，我們比較了3種PCI術(shù)前阿托伐他汀再負(fù)荷方法對(duì)長(zhǎng)期服用他汀的穩(wěn)定性冠心病患者圍術(shù)期循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞及炎癥因子的影響。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

血清肌鈣蛋白I(troponin I，TnI)檢測(cè)試劑盒(Beckman Coulter)； C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)由SYNCHRON System測(cè)定 (Beckman Coulter)；可溶性細(xì)胞間附分子Ⅰ (soluble intercellular adhesion molecule 1,sICAM-1) ELISA 試劑盒(Bender)；藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的小鼠抗人CD133/AC133和CD144單克隆抗體(Miltenyi Biotec)；藻紅蛋白-花青素5(phycoerythrin and cyanidin 5，PC5)標(biāo)記的鼠抗人CD45單克隆抗體(Beckman Coulter)；別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)標(biāo)記的鼠抗人CD34單克隆抗體(Miltenyi Biotec)；FITC標(biāo)記的小鼠抗人VEGFR-2/KDR單克隆抗體和流式檢測(cè)專用紅細(xì)胞裂解液(R&D)。

2 患者資料

45例長(zhǎng)期服用他汀的并選擇擇期行PCI的穩(wěn)定性冠心病患者隨機(jī)分成3組。穩(wěn)定性冠心病患者定義為：由于運(yùn)動(dòng)或其它增加心肌需氧量的情況所誘發(fā)的短暫胸痛發(fā)作，休息或舌下含服硝酸甘油后疼痛常可迅速消失且病程穩(wěn)定在1個(gè)月以上[9]。入選標(biāo)準(zhǔn)：45歲以上80歲以下男性及絕經(jīng)后女性；長(zhǎng)期接受他汀治療(>8周)，接受擇期PCI術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性冠脈綜合征，糖尿病，ALT/AST大于正常上限，肌酐>30 mg/L，左心室射血分?jǐn)?shù)<30%，具有明確感染灶的急慢性感染，血液系統(tǒng)疾病，腫瘤，全身免疫性疾病。

3 方法

3.1分組 45例符合入排標(biāo)準(zhǔn)的患者隨機(jī)分成3組。所有患者 PCI術(shù)前1 h、術(shù)后1 h、術(shù)后6 h及術(shù)后24 h分別留取外周血用于EPCs測(cè)定。PCI術(shù)前即刻及術(shù)后24 h測(cè)定TnI水平；按照2012年發(fā)布的第三版全球心肌梗死定義中PCI相關(guān)心肌梗死的定義為PCI術(shù)后肌鈣蛋白較99%正常上限值升高達(dá)5倍[10]。sICAM-1與CRP是被認(rèn)為與冠心病相關(guān)的炎癥因子，我們分別于PCI術(shù)前即刻及術(shù)后24 h測(cè)定這2種蛋白的外周血水平。臨床隨訪了PCI術(shù)后30 d的主要不良心臟事件(major adverse cardiac events，MACEs)，包括死亡、非致死性心肌梗死和靶血管血運(yùn)重建事件。

3.2內(nèi)皮祖細(xì)胞檢測(cè) 將所采集的3mL靜脈全血標(biāo)本各取100μL，分別加入4管BD公司流式細(xì)胞儀專用檢測(cè)管中；各加入5μL胎牛血清，室溫條件下孵育15min以阻斷Fc片段。隨機(jī)抽取1管作陰性對(duì)照，抽取第2管中加入10μL由PE標(biāo)記的CD133/AC133抗體及10μL由FITC標(biāo)記的VEGFR-2/KDR抗體，在第3管中加入10μL由FITC標(biāo)記的VEGFR-2/KDR抗體及由APC標(biāo)記的CD34抗體，最后1管中加入10μL由FITC標(biāo)記的VEGFR-2/KDR抗體及PE標(biāo)記的CD144抗體，最后在所有檢測(cè)管中加入PC5標(biāo)記的CD45抗體5μL，混勻后置于4 ℃冰箱中避光孵育45min?；靹蚝蠹尤肓魇郊?xì)胞儀檢測(cè)專用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，振蕩混勻，置于37 ℃恒溫箱中避光放置10min，接著以1 500r/min離心5min后棄上清；再加入3mLPBS，混勻后以1 500r/min再次離心5min，棄上清，加入500μLPBS液，充分振蕩混勻，最后利用FACSCalibur流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)分析100μL中CD45-/CD133+/CD34+標(biāo)記細(xì)胞CD45-/CD34+/KDR+以及CD45-/CD144+/KDR+標(biāo)記細(xì)胞的總數(shù)來代表外周血EPCs數(shù)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有資料利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)；對(duì)有相關(guān)趨勢(shì)的變量進(jìn)行相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 基本情況的比較

3組患者組間基線特征匹配良好，無顯著差異，見表1；PCI治療及術(shù)后MACEs發(fā)生情況統(tǒng)計(jì)均無明顯差異,見表2。

表1 患者臨床基線資料

表2 3組患者PCI治療及MACE事件

MACEs included death in 30 d after PCI, non-fatal myocardial infarction and target vessel revascularization.

2 PCI術(shù)前與術(shù)后內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化

在80 mg再負(fù)荷組，標(biāo)記為CD45-/CD133+/CD34+和CD45-/CD34+/KDR+的EPCs 術(shù)后1 h及術(shù)后6 h與術(shù)前相比明顯升高(P<0.05)，見表3。80 mg再負(fù)荷組標(biāo)記為CD45-/CD133+/CD34+的 EPCs 術(shù)后1 h及術(shù)后6 h較術(shù)前相比分別升高了1.6倍及1.3倍。標(biāo)記為CD45-/CD34+/KDR+的EPCs術(shù)后1 h及術(shù)后6 h較術(shù)前相比分別升高了1.4倍和1.7倍。標(biāo)記為CD45-/CD144+/KDR+的EPCs水平術(shù)后較術(shù)前無顯著差異。對(duì)照組及40 mg再負(fù)荷組患者術(shù)前與術(shù)后外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞水平的比較無顯著差異，見表3。80 mg再負(fù)荷組標(biāo)記為CD45-/CD133+/CD34+及 CD45-/CD34+/KDR+的EPCs 在術(shù)后6 h達(dá)到最高峰，并且在術(shù)后24 h恢復(fù)到術(shù)前水平。對(duì)照組及40 mg再負(fù)荷組，大部分患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞水平術(shù)后1 h達(dá)到最高峰并且基本維持在這一水平。

表3 3組患者不同抗體標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞PCI術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)的變化情況

*P<0.05 vspre-operation.

3 PCI術(shù)前與術(shù)后sICAM-1 與CRP的變化

3組患者術(shù)后sICAM-1及CRP水平均較術(shù)前升高，其中無負(fù)荷組升高最為明顯，與術(shù)前相比差異顯著(P<0.05)；40 mg再負(fù)荷組和80 mg再負(fù)荷組術(shù)后sICAM-1及CRP水平雖有升高，但與術(shù)前比較無顯著差異，見表4。另外，他汀的劑量增加伴隨著術(shù)后炎癥因子水平的下降，提示大劑量他汀再負(fù)荷治療可以減少圍術(shù)期血漿炎癥水平。

表4 3組患者PCI術(shù)前與術(shù)后sICAM-1 及CRP的變化情況

*P<0.05vspre-operation.

4 PCI術(shù)前與術(shù)后血清TnI的變化

在3組患者中術(shù)后血清TnI水平均較術(shù)前顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但他汀再負(fù)荷組，圍術(shù)期的心肌損傷較對(duì)照組存在減輕趨勢(shì)。80 mg再負(fù)荷組術(shù)后血清TnI增加水平與對(duì)照組相比明顯減少，見表5。按照2012年發(fā)布的第三版全球心肌梗死定義中PCI相關(guān)心肌梗死的定義(PCI術(shù)后肌鈣蛋白較99% 正常上限值升高達(dá)5倍)，無他汀負(fù)荷組為8例，40 mg他汀負(fù)荷組為6例，80 mg他汀負(fù)荷組為3例；他汀再負(fù)荷組較無他汀負(fù)荷組發(fā)生圍術(shù)期心肌梗死呈減少趨勢(shì)。

表5 3組患者PCI術(shù)前術(shù)后TnI水平的比較

*P<0.05vspre-operation.

討 論

冠心病患者往往合并存在內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員減少及功能下降[11-14]。ARMYDA-RECAPTURE研究證實(shí)PCI術(shù)前他汀再負(fù)荷治療可以減輕圍術(shù)期心肌損傷。同時(shí)Vasa等[16]的研究顯示在冠心病患者服用阿托伐他汀(40 mg/d)治療4周后，外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量較服用前顯著增加。然而Hristov等[17]的研究顯示長(zhǎng)期(大于8周)應(yīng)用他汀治療可降低外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量。上述不同發(fā)現(xiàn)使我們想到是否因?yàn)殚L(zhǎng)期他汀治療使內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)常規(guī)劑量他汀治療不再敏感； 也可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期他汀治療使結(jié)合內(nèi)皮祖細(xì)胞的整聯(lián)蛋白正向調(diào)節(jié)，這就要求更大劑量的他汀類藥物以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員；最后PCI術(shù)前他汀如何治療可以使獲益最大化需要進(jìn)一步研究來探討。

EPCs是人體生理或病理過程中一群動(dòng)態(tài)演變的細(xì)胞系列。在體外培養(yǎng)中，附著在培養(yǎng)皿表面的EPCs從橢圓形逐漸變成紡錘形，隨著內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化和成熟，EPCs開始表達(dá)特定的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，這使得他們能夠從其它的各種干細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中成熟的內(nèi)皮細(xì)胞類型區(qū)分開來。以CD34+/CD133+/KDR+來標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞是目前主要一種方式。體外標(biāo)記為CD133+的細(xì)胞在外周血中可被誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮細(xì)胞，此時(shí)它們不再表達(dá)CD133，因此CD133的表達(dá)是內(nèi)皮祖細(xì)胞的特定標(biāo)簽，并可以使內(nèi)皮祖細(xì)胞從成熟內(nèi)皮細(xì)胞中區(qū)分出來。CD34被認(rèn)為是造血干/祖細(xì)胞的標(biāo)志物，但標(biāo)記為CD34-的EPCs亞群也有報(bào)道[18]。KDR是表達(dá)在成熟內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶受體。然而，內(nèi)皮祖細(xì)胞不表達(dá)血管性血友病因子(vWF)和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(CD144)[11]。隨著內(nèi)皮祖細(xì)胞分化和成熟，vWF及CD144的表達(dá)增強(qiáng)，CD133的表達(dá)降低。一旦內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，CD133的表達(dá)缺失。最后，CD45是白細(xì)胞的表面標(biāo)記，在內(nèi)皮祖細(xì)胞中基本不表達(dá)。因此，將不同的表面比較組合起來可以區(qū)分不同分化階段的內(nèi)皮祖細(xì)胞。因此本研究中檢測(cè)分別代表祖細(xì)胞(CD45-/CDl33+/CD34+標(biāo)記細(xì)胞)，分化較早期的EPCs (CD45-/CD34+/ KDR+標(biāo)記細(xì)胞)和分化較晚期的EPCs(CD45-/CD144+/ KDR+標(biāo)記細(xì)胞)系列以期較為全面地反映EPCs在PCI圍術(shù)期的的變化。

在我們的研究中，2種他汀再負(fù)荷治療方案均能減少患者圍術(shù)期心肌損傷，但是術(shù)前12 h服用80 mg阿托伐他汀及術(shù)前2 h追加40 mg阿托伐他汀再負(fù)荷方案較無他汀負(fù)荷組圍術(shù)期心肌損傷的減少顯著(P<0.05)，而PCI術(shù)前連續(xù)7 d服用40 mg阿托伐他汀再負(fù)荷治療與無負(fù)荷組比較，圍術(shù)期心肌損傷僅呈減少趨勢(shì)。我們的研究顯示在無他汀負(fù)荷組患者中長(zhǎng)期他汀治療的圍術(shù)期循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的水平并不增高，但PCI術(shù)前給予短期大劑量阿托伐他汀治療的患者可以提高圍術(shù)期循環(huán)分化較早期內(nèi)皮祖細(xì)胞的水平。上訴研究結(jié)果表明在長(zhǎng)期服用他汀治療的患者中PCI術(shù)前短期大劑他汀治療可以動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞。我們研究的局限性是一個(gè)相對(duì)較小的樣本規(guī)模和缺乏對(duì)EPCs的功能研究。此外，圍PCI手術(shù)期心肌缺血可能通過活化血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞活化；其它PCI相關(guān)病理生理改變特別是在對(duì)照組中EPCs活化可能影響了血清sICAM-1和CRP血清水平。另外，PCI術(shù)中心肌缺血可能通過刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的釋放而動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)帶來其它的病理生理改變特別是在對(duì)照組中出現(xiàn)的sICAM-1及CRP水平的升高。

總之，我們的研究結(jié)果提示PCI術(shù)前短期大劑量再負(fù)荷治療可以提高長(zhǎng)期服用他汀治療的穩(wěn)定性冠心病患者PCI治療效果。PCI術(shù)前短期接受大劑量他汀再負(fù)荷治療的穩(wěn)定性冠心病患者外周血分化較早期的內(nèi)皮祖細(xì)胞顯著升高并且心肌損傷指標(biāo)血清TnI顯著降低。阿托伐他汀是我們的研究中唯一用到的他汀并且樣本量較小，在以后的研究中可以增加樣本量同時(shí)可以使用其它種類的他汀來觀察是否有類似作用。

致謝: 感謝寧波市第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室周影在流式細(xì)胞儀應(yīng)用方面的指導(dǎo)，感謝陳瑩在本實(shí)驗(yàn)期間提供的幫助。

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