大鼠急性腦缺血模型中基質金屬蛋白酶9和轉化生長因子β1的表達及其組織來源分析*

王艷國， 李得春， 胡 海， 張 圓

(包頭醫學院 1病理生理學教研室， 2第一附屬醫院檢驗科，內蒙古 包頭 014060)

急性缺血性腦卒中是指各種原因所致腦部血液供應障礙，導致腦組織缺血、缺氧性壞死，出現相應的神經功能缺損癥狀，其具有發病率高、病死率高與致殘率高等特點，嚴重威脅著人類的健康。缺血性腦卒中的嚴重并發癥之一是出血轉化，即腦血管在急性缺血缺氧后，血管內皮細胞壞死，細胞間隙加大，合并局部代謝物蓄積刺激，導致腦血管壁通透性增高，血液成分滲出，嚴重者甚至發生局部腦血管破裂，并發腦出血，造成更為嚴重的神經功能損害[1]。但是，出血轉化的機制一直不是十分明確，近年來的研究發現基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)的表達與出血性轉化相關[2]。

MMP-9是基質金屬蛋白酶家族成員之一, 又稱為明膠酶B，生理情況下MMP-9主要生物學功能是參與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的降解及重構。腦血管基底膜與間質內的細胞外基質是維持血腦屏障完整的重要結構基礎，其細胞外基質的重要成分如膠原、糖蛋白、脂蛋白等均為MMP-9的作用底物，病理情況下MMP-9 可以通過降解細胞外基質使血-腦屏障受損，通透性增加。國外的臨床研究[3-4]和我們的前期工作[5]均表明血漿MMP-9 水平升高的缺血性腦卒中患者比MMP-9水平未升高的患者更容易發生出血轉化，并且MMP-9 水平高低與發生出血轉化的嚴重程度相關。亦有研究表明，MMP-9基因序列的-474處有轉化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)抑制元件的序列，TGF-β1可以作用于此，在基因水平抑制MMP-9的轉錄，從而減少細胞外基質降解，降低出血轉化發生率[6]。

但是，目前相關研究對急性缺血性腦卒中MMP-9和TGF-β1表達變化規律尚存爭議[7]，更重要的是缺血性腦卒中MMP-9和TGF-β1的組織來源尚不清楚，而臨床研究多通過采集血樣來開展，在確定組織來源方面較為困難。因此，本研究通過建立大鼠急性腦缺血模型，觀察急性腦缺血卒中大鼠組織中MMP-9和TGF-β1的表達情況，并對其主要組織來源進行了初步探究；同時在相應時點檢測大鼠血漿MMP-9和TGF-β1濃度的動態變化。

材 料 和 方 法

1 動物

10～12周齡、體重280～330 g清潔級雄性Wis-tar大鼠，購于包頭醫學院動物中心，喂養于本院實驗動物中心動物房，給予滅菌處理后的飼料及飲用水，所有動物實驗遵照包頭醫學院實驗動物倫理學規定。

2 主要試劑及儀器

TRIzol試劑購自Invitrogen；PrimeScript逆轉錄試劑盒、RNase Inhibitor 、Oligo d(T)15引物和dNTP Mixture均購自TaKaRa；SYBR Green JumpStartTMTaq購自Sigma；抗大鼠MMP-9和TGF-β1抗體均購自Abcam；大鼠MMP-9和TGF-β1的ELISA檢測試劑盒購自BD；7500型Q-PCR儀購自ABI；酶標儀購自BioRad。

3 主要方法

3.1大鼠線栓法急性腦缺血模型的建立 大鼠術前稱體重, 按7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉后, 仰臥位固定于自制的固定板上。實驗全部選用左側大腦中動脈，采用石蠟線栓法建立大鼠永久大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，按完全隨機化原則分為正常對照組、假處理組，每組各18只；急性缺血性卒中6 h、12 h、1 d、3 d、7 d和14 d組，每組6只，共計72只。術后動物蘇醒良好，送回動物房保證水糧充足。神經功能評分采用Zealonga 5 分制評分法：0分，不出現神經功能癥狀；1分，出現左側Horner；2分，拎起尾巴時，右前爪不能伸直；3分，向右側轉圈；4分，向右側傾倒；5分，死亡。1～4分視為模型成功。

3.2實時熒光定量PCR檢測MMP-9和TGF-β1的表達 分離海馬和大腦皮質，分別研磨，加入TRIzol，參照說明書提供的方法抽提總RNA，將提出的腦組織總RNA溶于約10μLDEPCH2O中，總RNA經紫外分光光度計測定濃度，取1μg總RNA在 20μL體系逆轉錄得到cDNA。在PCR反應管內，先加入模板1μL，然后加入10μmol/L上、下游引物各0.5μL，SYBRGreenreal-timePCRMix10μL，用水補足反應體積至20μL。Q-PCR反應的引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成，序列見表1。

表1 定量PCR引物序列

3.3MMP-9和TGF-β1組織化學染色 分別在6 h、12 h、1 d、2 d、6 d和14 d 時，以CO2麻醉法處死大鼠。取各組大鼠腦組織標本置于4%多聚甲醛固定液中浸泡固定24 h后入全自動脫水儀梯度脫水，脫水后用石蠟包埋，并用石蠟切片機對蠟塊進行5 μm厚連續冠狀切片，置于載玻片上，烤片，常規二甲苯脫蠟，乙醇脫水。用抗大鼠MMP-9和TGF-β1抗體，按照說明書要求進行組織化學原位染色。染色面積的比較通過軟件(Image-Pro Plus 6.0)進行定量。

3.4ELISA檢測大鼠血漿中MMP-9和TGF-β1麻醉各時點模型大鼠后開腹，從下腔靜脈用肝素抗凝采血管抽血5mL，以2 000×g離心20min取上清，用于ELISA檢測。根據試劑盒說明書要求操作并且使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的A值,MMP-9和TGF-β1的表達水平以ng/L表示。

4 統計學處理

用SPSS 18.0統計軟件分析。數據以均數±標準差表示。組間比較采用兩個獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。Real-time PCR結果使用7500 Software V2.0.6軟件進行數據處理和分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 成功建立大鼠急性腦缺血模型

正常對照組(18只)和假手術組大鼠(18只)清醒后精神、飲食和活動基本正常，均未發現明顯神經功能缺損癥狀和體征, 神經功能評價均為0 分。模型組大鼠清醒后出現精神萎靡、反應遲鈍及食欲不振等癥狀，同時發現大鼠出現不同程度的行走時轉圈，身體向一邊傾倒，提頸時右側肢體屈曲，上抬困難甚至右側偏癱等神經功能缺損體征，神經功能評價為1～4 分。通過Zealonga 5 分制評分法對缺血組大鼠進行神經功能評分，結果為： 1分10只，2分13只，3分12只，4分1只。

2 Real-time PCR 檢測缺血大鼠腦組織中MMP-9和TGF-β1的表達

正常對照組與假處理組所表達的MMP-9水平差別沒有統計學意義。與假處理組大鼠相比，MMP-9 mRNA水平在急性缺血6 h即開始升高，到急性缺血2 d時最高，缺血各組分別與假處理組樣本相比，差異均有統計學意義，見圖1。而TGF-β1mRNA水平在急性缺血12 h開始升高，到急性缺血6 d時達到最高水平，之后直到14 d TGF-β1mRNA的表達水平緩慢回落。正常對照組與假處理組所表達的TGF-β1水平差別沒有統計學意義。與假處理組樣本相比，缺血時間為12 h、1 d、2 d、6 d和14 d的樣本差異有統計學意義，見圖2。正常對照組與假處理組所表達的TGF-β1水平差異沒有統計學意義。

Figure 1. The mRNA level of MMP-9 in the brain of sham rats and acute cerebral ischemia rats.Mean±SD.n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs sham.

Figure 2. The mRNA level of TGF-β1 in the brain of sham rats and acute cerebral ischemia rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs sham.

3 組織化學染色觀察缺血大鼠腦組織中 MMP-9和TGF-β1的表達

對正常對照組、假處理組、急性腦缺血后6 h、12 h、1 d、2 d、6 d和14 d 采集的大腦切片，進行MMP-9組織化學染色后發現，正常對照組和假處理組樣本上基本沒有MMP-9表達，而從急性腦缺血后1 d起，大腦的皮質和海馬區域開始有MMP-9表達。急性腦缺血后2 d左右，大腦皮質的MMP-9表達最高，對大腦皮質和海馬區域的MMP-9的陽性面積進行定量分析，發現其遠高于假處理組(皮質1.76%±0.51%vs8.66%±2.08%；海馬2.83%±0.50%vs14.67%±4.04%),見圖3。而TGF-β1組織化學染色后發現：在急性缺血2 d后皮質和海馬區域開始能觀察到TGF-β1表達，6 d時最明顯(皮質1.26%±0.49%vs8.33%±2.56%；海馬1.54%±0.49%vs11.67%±3.05%)，之后開始減少,見圖4。

Figure 3. The expression of MMP-9 in rat brains 2 d after acute cerebral ischemia.Scale bar=500 μm.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs sham.

Figure 4. The expression of TGF-β1 in rat brains 2 d after acute cerebral ischemia. Scale bar= 500 μm.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs sham.

4 ELISA檢測大鼠血漿中MMP-9和TGF-β1

ELISA結果顯示缺血后12 h，血漿中即可檢測到MMP-9和TGF-β1的表達。與假處理組相比，缺血1 d時2種蛋白的表達差異有統計學意義，見圖5、6。

討 論

急性缺血性腦卒中現在已經是心腦血管系統的常見病，多發病。臨床常常采用溶栓藥物加以治療，以求改善被栓塞區腦組織的功能。但是，部分急性腦缺血卒中患者常常伴發出血轉化，如果這部分人群給予溶栓治療，則會導致腦缺血向腦出血轉化，加重病人的組織損傷，影響神經功能。因此，探究急性腦缺血后出血轉化的機制和動態變化規律，對于闡明相關病理過程，優化治療策略，具有積極意義。

我們的前期工作通過采集多例發生了出血轉化和未出現出血轉化的急性腦缺血性卒中病人的血漿[4]，發現了MMP-9的血漿水平和出血轉化之間具有一定聯系，提示血漿MMP-9濃度高的患者更傾向于發生出血轉化。但是，收到臨床工作的實際和醫學倫理學的限制，未能對MMP-9的濃度進行多時點的動態觀察。其次，急性缺血性腦卒中患者體內MMP-9的組織來源問題一直未見明確報道，而動物實驗有利于明確腦組織原位MMP-9表達情況。再次，有研究表明，在急性缺血性腦卒中時，TGF-β1可能與MMP-9的表達具有相關性，但是也缺乏體內實驗研究的結果[8]。

Figure 5. The MMP-9 expression in the plasma of sham rats and acute cerebral ischemia rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs sham.

Figure 6. The TGF-β1 expression in the plasma of sham rats and acute cerebral ischemia rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs sham.

血-腦屏障主要由腦毛細血管內皮細胞、血管基底膜及膠質細胞終足構成，血管基底膜與間質內的細胞外基質是維持血腦屏障完整的重要結構基礎。腦組織中MMP-9的水平升高可以通過降解細胞為基質，直接增加血腦屏障的通透性，其病理意義比血漿中MMP-9含量的意義更為重要。本研究首先成功建立了大鼠急性腦缺血模型，然后通過組織化學染色，發現建模后12 h，動物的大腦皮質和海馬即可有MMP-9表達，而以2 d時最為明顯，而對其腦組織的MMP-9 mRNA水平進行分析，發現其在缺血后6 h即開始上升，該結果與組織化學染色結果相互印證。血清中的MMP-9在缺血1 d左右顯著升高，缺血6 d達到最高峰。

TGF-β1是具有多重調節功能的細胞轉化生長因子, 其生物學作用復雜多樣,并依據不同的細胞類型和病理環境而發生變化。傳統觀點認為TGF-β1可促進神經元生存，促進其分化, 增加神經元的軸突數目, 并具有加速神經組織修復的作用[6]。在本研究中，TGF-β1的表達與MMP-9的表達具有一定相關性，具體表現為MMP-9在急性腦缺血早期出現，然后緩慢回落。而TGF-β1在急性腦缺血后出現的時間晚于MMP-9，然后在缺血6 d 時上升到一較高水平然后回落，其內在機制仍有待進一步研究。血清中的TGF-β1在缺血1 d 左右即顯著升高，在缺血后6 d 達到峰值。但是，MMP-9的回落是否和TGF-β1相關，仍有待進一步研究。

[參 考 文 獻]

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