miRNA-7通過EGFR/PI3K/Akt通路抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖*

孫棟勛, 黃棟棟, 金巧智, 陳武兵, 蔡志毅,△

(1溫州醫科大學第一臨床醫學院，浙江 溫州 325000； 2臺州學院醫學院附屬市立醫院耳鼻咽喉科，浙江 臺州 318000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)為我國南方高發的一種惡性腫瘤，嚴重威脅我國人民的身心健康和生命安全?，F已知NPC不僅與EB病毒、化學致癌物等因素有關，且有一定的遺傳傾向，是一種多基因多階段侵襲性疾病。這可能與癌基因激活和抑癌基因失活所致的細胞惡性增殖致使細胞癌變的發生有關。

微小RNA(microRNA，miRNA)作為新近發現的又一類非編碼小RNA分子，在轉錄后基因表達調控方面起著極其重要的作用, 現已成為當今生命科學領域的研究熱點和前沿之一[1]。miRNA主要通過與靶基因mRNA的3’-編碼區(3’-untrans latied region,3’-UTR)的不完全或完全配對，引起靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，并通過調節下游基因的表達來調控細胞增殖及分化等生命活動，進而發揮類似癌基因或抑癌基因的作用[2-4]。miRNA-7是近期發現的在某些腫瘤中具有抑癌作用的一類微小RNA，它的序列與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR) 3’-UTR區存在至少3個區域的不完全互補，能降低EGFR的表達[5]。以往的研究發現，EGFR在Ⅱ期和Ⅲ期非角化性鼻咽癌活檢標本中的陽性表達率高達70.53%,并與原發瘤的進展呈相關性[6]。此外，EGFR在鼻咽癌組織中的表達也明顯高于正常鼻咽部組織，而抑制EGFR的表達能降低鼻咽癌細胞的增殖與侵襲轉移能力[7]。這些研究結果提示，鼻咽癌的發生發展可能與miRNA-7通過調節EGFR及其下游通路其它關鍵因子的表達相關。本研究擬通過miRNA基因轉染技術來阻斷EGFR及其下游相關通路mRNA和蛋白的表達，探討miRNA-7在體外對鼻咽癌細胞惡性增殖能力的影響及尋找鼻咽癌新的miRNA活性特異性治療靶點。

材 料 和 方 法

1 材料

人低分化和高成瘤鼻咽癌5-8F細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。RPMI-1640培養基、Opti-MEM I無血清培養基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液均購自Gibco；PBS緩沖液購自Thermo；CCK-8試劑盒購自Bryotime；RNA抽提試劑Trizol reagent、細胞轉染試劑Lipofectamine 2000(Lipo2000)和miRNA第1鏈合成試劑盒購自Invitrogen；cDNA第1鏈合成試劑盒、RealMasterMix(SYBR Green)熒光定量PCR試劑盒購自Tiangen；兔抗人GAPDH、EGFR、p-EGFR、PI3K、Akt、p-Akt單克隆Ⅰ抗購自Cell Signaling;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅱ抗購自Biosharp；miRNA-7模擬物及無關序列(negtive control，NC)由Ribobio合成。

2 主要方法

2.1細胞培養與轉染及轉染效率的檢測 將5-8F細胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕密閉培養箱中培養，隔日換液或傳代培養。實驗分3組：(1) miRNA-7+Lipo2000組 (miRNA-7組)；(2) NC+Lipo2000組 (NC組)；(3) 正?？瞻讓φ战M (control組)。將細胞以3×105cells/well接種于6孔板，2.5×103cells/well接種于96孔板中，培養24 h后換新鮮培養液，按操作說明以等量Opti-MEM I無血清培養基分別稀釋適當量的miRNA-7/NC和Lipo2000，混勻后各自室溫靜置5 min，后將兩者混勻室溫下共孵育15～20 min，加入培養板中，輕輕混勻，放入培養板中繼續培養，隔6～8 h后換完全培養基繼續培養。轉染帶熒光的Cy3-NC時，所有操作均需避光操作，并以錫箔紙包被培養板放置培養箱中培養，轉染24 h后用PBS沖洗1次，熒光顯微鏡下觀察轉染效率并拍照。

2.2Real-time PCR檢測miRNA-7的表達 各組5-8F細胞經轉染48 h后，按照Trizol說明書中步驟抽提細胞總RNA，取RNA于紫外分光光度計下測A260/A280，比值處于1.8～2.1之間則符合純度要求。按miRNA逆轉錄試劑盒說明配制逆轉錄試劑，逆轉錄合成cDNA，將合成的cDNA稀釋10倍，按real-time PCR說明書配制反應體系，每個樣本設3個復孔。PCR反應步驟：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。反應以U6為內參照。miRNA-7引物序列：上游引物5’-AAA AAG AAC ACG TGG AAG GAT AG-3’，下游引物5’-CCG CCT AAC GTA CCG CGA ATTT-3’。U6引物序列：上游引物5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游引物5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。記錄各孔CT值，取各孔平均值作為結果，并采用2-ΔΔCt法對結果進行分析。

2.3CCK-8法檢測細胞增殖能力 取96孔板按上述方法轉染各組5-8F細胞，另于標準空白孔中加不含細胞的完全培養液(每組取4孔)，培養48h后于每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕晃混勻，放置于培養箱中培養1～2h，再測450nm波長下每孔的A值，觀察各組細胞增殖能力變化情況。

2.4平板克隆法檢測細胞克隆形成情況 于6孔板中轉染各組5-8F細胞24 h后，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min收集細胞，重懸細胞并計數，以800 cells/well接種于新的6孔板中，并盡量使細胞均勻分布于板底，放入培養箱中連續培養10 d，或至肉眼可見克隆斑時，棄原培養液，PBS洗滌1次后加10%甲醛固定15 min,PBS洗2次后用結晶紫染色30 min，PBS洗凈后晾干，拍照。

2.5Real-timePCR檢測各mRNA的表達 按照前述方法抽提各組5-8F細胞總RNA，按cDNA第1鏈合成試劑盒說明配制逆轉錄反應液，逆轉錄合成cDNA后，采用SYBRGreen熒光染料，參照試劑盒說明配制PCR反應體系，每組設置3個復孔。PCR反應步驟： 95 ℃ 2min； 95 ℃ 15s， 60 ℃ 30s， 68 ℃ 1min，共40個循環。反應以GAPDH為內參照。GAPDH引物序列：上游引物5’-CATCAGCAATGCCTCCTGCAC-3’，下游引物5’-TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3’；EGFR引物序列：上游引物5’-CTTGATTCCAGTGGTTCTGCTTC-3’，下游引物5’-CATCCCCTCCGTTTCTTCTTT-3’；磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidylinostol3-kinase,PI3K)引物序列：上游引物5’-CTGTGTGGGACTTATTGAGGTGGT-3’，下游引物5’-ACTGATGTAGTGTGTGGCTGTTGA-3’；Akt引物序列：上游引物5’-TGTGAAGGAGGGTTGGCTGC-3’，下游引物5’-ACTGCGCCACAGAGAAGTTGTT-3’。記錄各孔CT值，取3孔平均值作為結果，并采用2-ΔΔCt法對結果進行分析。

2.6Western blotting檢測各蛋白的表達 轉染各組5-8F細胞72 h后，胰酶消化收集細胞于1.5 mL離心管中，PBS洗滌1次，每孔加入200 μL 1×SDS loading buffer，反復吹打攪拌，使細胞充分裂解，95～100 ℃煮沸10 min，10 000 r/min離心10 min，收集的上清液即為樣本蛋白。順序加樣，待電泳分離完全后，采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST充分洗膜后加特異性Ⅰ抗，Ⅰ抗稀釋比例為GAPDH(1∶10 000)、EGFR(1∶1 000)、p-EGFR(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶2 000)、p-Akt(1∶2 000)，4 ℃過夜孵育，Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育1.5 h，充分洗膜后加ECL發光液顯影，ImageQuant LAS 4 000 Mini凝膠成像儀自動曝光，并分析灰度值，計算各組與內參照GAPDH灰度的相對比值。每個樣本重復3次實驗。

3 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多樣本均數之間比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間采用最小顯著性差異法(LSD法)進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 細胞轉染情況

用帶有Cy3熒光蛋白的無關序列(Cy3-NC)轉染人鼻咽癌5-8F細胞24 h后，于熒光顯微鏡下觀察，轉染效率在85%左右，見圖1。

Figure 1. The expression of Cy3 fluorescin in human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells 24 h after transfection (×100).

2 miRNA-7在5-8F細胞中的表達情況

人鼻咽癌5-8F細胞經轉染miRNA-7或NC處理后48 h, 提取各組細胞總RNA并逆轉錄合成cDNA，經real-time PCR 檢測結果見圖2，根據2-ΔΔCt法計算出miRNA-7在miRNA-7組、NC組及空白對照組中相對于U6的表達量分別為677.00±4.58、1.08±0.01和0.99±0.02，應用單因素方差分析對計算結果進行統計顯示轉染后miRNA-7組的miRNA-7的表達量相對NC 組及空白對照組明顯上調(P<0.01)，NC組和control組之間則差異不明顯(P>0.05)。

Figure 2. The expression on miRNA-7 in human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells after transfection with miRNA-7 mimics. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control and NC.

3 miRNA-7抑制5-8F細胞增殖情況

人鼻咽癌5-8F細胞經轉染miRNA-7模擬物或NC處理48 h后分別加入CCK-8試劑進行檢測，并于450 nm 波長下檢測各孔的A值，A值越高則提示活細胞數越多，表明細胞增殖活性也越高。miRNA-7組、NC組及control組的A值分別為0.736±0.020、0.926±0.020和0.945±0.010，統計分析結果顯示miRNA-7組的A值與NC組和control組相比，差異顯著(P<0.01)，然而NC組和control組相比則無明顯差異(P>0.05)，見圖3。結果表明，上調miRNA-7表達后5-8F細胞的增殖能力被顯著抑制。

Figure 3. The proliferation of human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells 48 h after transfection with miRNA-7 mimics by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control and NC.

4 miRNA-7對細胞平板克隆形成的影響

結果顯示，miRNA-7組克隆斑形成數與NC組和control組相比明顯減少，細胞生長增殖能力明顯受抑制，而NC組和control組克隆斑形成數量則無明顯差異，見圖4。

5 miRNA-7對EGFR、PI3K及Akt mRNA表達的影響

Control組5-8F細胞中EGFR/PI3K/Akt通路各成員的mRNA表達量按1計算，結果顯示miRNA-7組EGFR、PI3K及Akt的表達量相對于control組分別為0.66±0.04、0.65±0.02和0.76±0.03，而NC組則為0.95±0.02、0.91±0.03和0.93±0.02，統計分析結果顯示miRNA-7組5-8F細胞中EGFR/PI3K/Akt通路各成員的mRNA表達量與NC組和control組相比均明顯下調，差異有統計學意義(P<0.01)，而NC組和control組之間則無顯著差異(P>0.05),見圖5。

Figure 5. The effects of miRNA-7 transfection on the mRNA expressions of EGFR/PI3K/Akt in human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs mock and NC.

6 miRNA-7對EGFR/PI3K/Akt通路各蛋白表達的影響

結果顯示miRNA-7組EGFR、p-EGFR、PI3K、Akt及p-Akt相對內參照的表達量分別為0.37±0.03、0.27±0.02、0.10±0.01、0.19±0.02和0.09±0.01，NC組為0.68±0.02、0.56±0.03、0.26±0.02、0.61±0.01和0.45±0.03，control組則分別為0.73±0.02、0.53±0.01、0.24±0.01、0.62±0.02和0.41±0.01，統計結果顯示miRNA-7組5-8F細胞中EGFR/PI3K/Akt通路各成員的蛋白表達量與NC組和control組相比均顯著減少，差異有統計學意義(P<0.01)，而NC組和control組之間則無明顯差異(P>0.05)。

討 論

miRNA作為真核細胞內一類長度約19～25個寡核苷酸序列的非編碼小RNA，在細胞增殖、凋亡、遷移等多個生物進程中發揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。不同的miRNA分別相應調控不同的mRNA，并形成復雜的網絡調控系統，且存在相對細胞和組織特異性。人類基因組中僅存在數百個miRNA，與大量的siRNA片段相比，miRNA高度保守，同時具有時序性，其作用機制目前仍不是非常清楚。

研究發現，上調miRNA-218在HeLa細胞中的表達，可能通過Akt-mTOR通路來抑制腫瘤的增殖生長并促進其凋亡[8]。Zhang等[9]研究發現，miR-187*在人結腸癌細胞株中表達下調，而上調miR-187*表達可抑制結腸癌細胞增殖活性，并影響結腸癌細胞周期。此外，miRNA-182、miRNA-100和miRNA-25等均被研究發現與腫瘤的形成和發展相關。本研究針對的miRNA-7作為多種miRNA 中的1種，其與腫瘤形成和發展的關系已在部分腫瘤中得已證實。在針對舌鱗狀細胞癌的研究時發現，miRNA-7可以介導下調胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R) mRNA的表達來抑制腫瘤的增殖[10]。而在肺癌中，miRNA-7過表達后可以顯著抑制Toll樣受體9(toll-like receptors 9, TLR9)的信號轉導，并借此來抑制腫瘤的增殖[11]。此外，在大腸癌的裸鼠移植瘤模型實驗中發現，miRNA-7的過表達可以顯著抑制瘤體的形成和生長[12]。

Figure 6. The effects of miRNA-7 transfection on the protein expression of EGFR/PI3K/Akt in human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells by Western blotting.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control and NC.

EGFR/PI3K/Akt信號通路作為引發腫瘤發生的最經典的途徑中的1條，一直備受關注，它可以通過其各成員間一系列的級聯磷酸化反應來促進腫瘤細胞的增殖，抑制細胞凋亡，加快細胞侵襲、遷移以及耐受腫瘤治療等[13]?，F已發現miRNA可以介導調節EGFR/PI3K/Akt通路來影響腫瘤的發生發展，那么在鼻咽癌5-8F細胞中miRNA-7是否可以通過這一信號通路來影響腫瘤的惡性表型呢？為此，本研究通過體外瞬時轉染miRNA-7模擬物法來進行一系列的實驗研究。因為對于短期(<1周)的miRNA功能獲得性細胞研究而言，miRNA模擬物瞬時轉染法是最好的選擇，這可以使miRNA在細胞內的表達水平短期內急速升高并持續發揮作用。本研究熒光顯微鏡觀察結果顯示Lipo2000瞬時轉染法的轉染效率在85%左右，而Real-time PCR結果提示轉染后miRNA-7的表達量的確上調了幾百倍，表明轉染的效果很顯著，這為miRNA-7短期內在細胞內發揮其強效生物學活性作用提供了支持。轉染后，經CCK-8實驗檢測發現，轉染miRNA-7組的鼻咽癌5-8F細胞增殖能力較NC組及空白對照組明顯受抑制；而平板克隆形成實驗則顯示轉染后腫瘤克隆斑形成數量較對照組顯著減少，這表明miRNA-7可在體外顯著抑制鼻咽癌5-8F細胞的增殖生長，并顯著降低其致瘤性。此外，本研究分別檢測了EGFR/PI3K/Akt通路各成員mRNA和蛋白的表達情況，探究miRNA-7抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖和克隆形成的相關機制。結果顯示，轉染miRNA-7組細胞中EGFR/PI3K/Akt通路各主要成員的mRNA表達量呈現明顯下降，這表明miRNA-7在鼻咽癌5-8F細胞中可以與其靶基因EGFR的mRNA有效結合，并抑制其翻譯表達，進而抑制其下游通路中各主要成員的翻譯表達。另外，EGFR/PI3K/Akt通路各主要成員的蛋白表達水平也均顯著降低，尤其是EGFR和Akt磷酸化的蛋白表達水平顯著減少，這表明體外轉染miRNA-7后，可以有效減少其靶基因EGFR的磷酸化表達水平，并更影響其下游通路成員Akt的磷酸化表達，提示miRNA-7過表達后，可在鼻咽癌5-8F細胞中顯著下調其靶向通路EGFR/PI3K/Akt各主要成員mRNA的表達，并扭轉EGFR/PI3K/Akt通路各相關成員蛋白間的磷酸化級聯反應來降低鼻咽癌5-8F細胞的成瘤和增殖能力。

綜上所述，過表達的miRNA-7可以顯著抑制鼻咽癌5-8F細胞的增殖和克隆形成，其作用機制可能與miRNA-7介導下調EGFR/PI3K/Akt通路各成員間的級聯傳遞能力有關。然而，在miRNA-7介導的抑制鼻咽癌細胞增殖作用中，EGFR/PI3K/Akt通路的地位還有待更精確的實驗來分析，且分析EGFR/PI3K/Akt通路與其它miRNA-7的靶基因及靶向通路之間的交互作用也將是本課題組下一步研究的方向，闡明這些機制將更有助于miRNA-7介導的基因靶向治療作為一種新型的治療技術應用于臨床。

[參 考 文 獻]

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