白藜蘆醇對視網膜色素上皮細胞增殖的影響*

王雯婕， 陳 劍， 劉小勇， 曲藝欣， 周 清， 袁晟辰， 郝曉寧

(暨南大學附屬第一醫院眼科，廣東廣州 510632)

增生性玻璃體視網膜病變(proliferativevitreoretinopathy，PVR)是視網膜脫離的嚴重并發癥也是視網膜脫離復位手術失敗的常見原因[1]。PVR是指移行到脫離的視網膜表面和下方及脫離的玻璃體后表面的視網膜色素上皮細胞(retinalpigmentepithelium，RPE)和膠質細胞增殖形成膜，膜的收縮導致視網膜皺縮、固定及脫離的一種病變。PVR是常見的難治性致盲性眼病之一，約5%～10%的孔源性視網膜脫離發生PVR[2-3]。

目前，臨床上治療PVR的基本方法是玻璃體切割手術，盡管手術設備和技術都有很大提高，但是術后PVR復發仍很常見[4]。由于PVR是由細胞增生和收縮引起的病變，因此藥物治療抑制增殖膜的形成是治療的關鍵，主要有抗代謝藥、皮質類固醇、維生素及其衍生物等[5]，而天然植物源性藥物的研究目前也受到重視[6]。

白藜蘆醇(resveratrol,Res)是天然多酚類化合物，主要來源于葡萄、虎杖等植物。Res是一種生物性很強的天然抗氧化劑，有抗氧化、抗炎、降低血小板聚集、抗增殖和抗腫瘤等作用[7-8]。本文以視網膜色素上皮細胞株ARPE-19為研究對象，探討Res對ARPE-19細胞增殖的影響及其作用機制，為其用于PVR的治療和術后預防復發提供資料。

材 料 和 方 法

1 細胞、試劑和儀器

人視網膜色素上皮細胞株ARPE-19由中山眼科中心惠贈。

Res、胰蛋白酶干粉和EDTA(Sigma)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；DMEM/F12和胎牛血清(FBS)(HyClone)；小鼠抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(Proteintech)；RNA提取試劑盒、cDNA逆轉錄試劑盒和SYBR熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)。倒置顯微鏡(Leica)；酶標儀(Safire)；FACSAria流式細胞儀(BD)；激光共聚焦顯微鏡510(Zeiss)。

2 方法

2.1細胞培養及傳代 將ARPE-19細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養液中，并于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每2～3 d換液1次，待細胞生長至基本匯滿培養瓶底時，用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化，按1∶2～1∶3傳代培養。

2.2CCK-8檢測Res對ARPE-19細胞增殖的影響 將ARPE-19以1×104cells/well接種于96孔板，待細胞貼壁后，用含0、50、100、150、200和300μmol/LRes的培養基分別培養24 、48 和72h，0μmol/LRes處理組為對照組，吸去上清，各孔加入含10%CCK-8的培養基，培養箱孵育2.5h后酶標儀測450nm處吸光度(A)值。細胞增殖指數(proliferationindex)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%，空白組為不含細胞的培養基。每組5個復孔，實驗重復3次。

2.3流式細胞術檢測Res對ARPE-19細胞周期分布和凋亡的影響 將ARPE-19細胞以2×105cells/well接種于6孔板中，待細胞貼壁后用0、100、150及200 μmol/L Res分別處理細胞48 h，0 μmol/L Res處理組為對照組。胰蛋白酶消化收集細胞，加入70%冰乙醇固定過夜，離心后棄上清，PBS洗滌兩遍，加入200 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色，37 ℃避光孵育15 min，過濾后上流式細胞儀檢測細胞周期各期分布。收集各組細胞懸液，離心棄上清，200 μL binding buffer重懸，5 μL Annexin V-FITC染色孵育10 min，離心棄上清，200 μL binding buffer重懸，10 μL PI染色，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

2.4免疫熒光檢測Res對ARPE-19表達PCNA的影響 生長狀況較好的ARPE-19消化制備細胞懸液，接種2滴細胞懸液于裝有蓋玻片的6孔板中，2h后待細胞貼壁后每孔加入含0μmol/L、150μmol/LRes的培養基2mL，培養48h，PBS沖洗后多聚甲醛室溫固定20min，3g/L的TritonX-100破膜30min，5%驢血清封閉1h，加入PCNAⅠ抗4 ℃孵育過夜，洗去孵育液，加入Cy3熒光Ⅱ抗，室溫孵育40min，洗去孵育液，加DAPI核染，室溫孵育30min，洗去孵育液，滴抗熒光淬滅劑封片，4 ℃冰箱避光保存，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2.5Real-time PCR檢測PCNA、P21和P27 mRNA的表達 細胞分組同流式檢測，按Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，以逆轉錄產物為模板進行熒光實時定量PCR。反應體系為20 μL：2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 2 μL，dddH2O 6.8 μL。引物序列設計如下：PCNA的上游引物為5’-AGACTTTCCTCCTTCCCGCCTG-3’，下游引物為5’-AGGTCCTTGAGTGCCTCCAACA-3’；P21的上游引物為5’-TCCAGCGACCTTCCTCATCCA-3’，下游引物為5’-TCCATAGCCTCTACTGCCACCA-3’；P27的上游引物為5’-GGACGATCCTCCTCCAAGACAA-3’，下游引物為5’-CTGGGCATTCAGAGCGGGATTA-3’；β-actin的上游引物為5’-AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’，下游引物為5’-AAGGGTGTAACGCAGCAAAG-3’。反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，45個循環。結果用相對定量分析方法2-ΔΔCt分析。以β-actin為內參照計算PCNA、P21和P27的mRNA相對表達量。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0 軟件作統計處理，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，組間差異比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 倒置顯微鏡觀察ARPE-19細胞生物學特性

傳代后ARPE-19細胞24 h內已貼壁, 細胞逐漸由圓形伸展呈多形性,多呈紡錘形、短梭形及三角形等, 可見黑色素顆粒圍繞透明的細胞核周圍, 呈集落生長；4～5 d細胞生長開始融合，見圖1。

Figure 1. The morphology of ARPE-19 cells observed under inverted microscope (×50). A: 24 h after passage; B: 96 h after passage.

2 Res對ARPE-19細胞增殖的影響

Res對RPE增殖有一定的抑制作用，且隨著濃度和作用時間增加，其抑制作用增強，見表1。雖處理24 h時Res各濃度組與對照組有顯著差異(P<0.05)，但50～200 μmol/L組增殖率都大于60%，不能有效抑制細胞增殖；處理48 和72 h能有效抑制細胞增殖，各濃度組與對照組有統計學差異(P<0.05)，因此為使細胞達到半數抑制且不增加作用時間，處理48 h是最佳抑制時間，150 μmol/L是最佳濃度，見圖2。

表1不同濃度Res作用ARPE-19細胞24h、48h、72h后CCK-8結果

Table 1. TheA450 values of ARPE-19 cells treated with resveratrol at different doses for 24 h, 48 h and 72 h (Mean±SD.n=15)

Group24 h48 h72 hControl0.4528±0.03020.4882±0.01940.5017±0.0165Res 50 μmol/L0.3683±0.0307?0.3527±0.0202?0.3504±0.0220?Res 100 μmol/L0.3235±0.0251?0.2996±0.0187??0.2936±0.0261??Res 150 μmol/L0.3113±0.0238?0.2571±0.0207??0.2446±0.0245??Res 200 μmol/L0.2806±0.0267?0.2329±0.0212??0.1994±0.0204??Res 300 μmol/L0.2185±0.0275??0.1109±0.0186??0.0388±0.0252??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

3 Res對ARPE-19細胞周期的影響

100、150和200 μmol/L 的Res處理ARPE-19細胞48 h后，S期細胞所占百分比分別為(38.80±0.28)%、(41.28±0.07)%和(49.57±0.41)%，與對照組[(11.33±0.03)% ]相比，比例增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。實驗結果顯示Res對ARPE-19細胞的S期阻滯作用具有濃度-效應關系，隨作用濃度的增加S期所占比例逐漸增加。

4 Res對ARPE-19細胞凋亡的影響

Res作用于ARPE-19細胞48 h后，Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測結果顯示，正常細胞在流式細胞分析圖的B3區；早期凋亡在流式細胞分析圖的B4區；晚期凋亡在流式細胞分析圖的B2區；流式細胞分析圖的B1區為機械損傷細胞。白藜蘆醇對ARPE-19細胞沒有毒性作用，方差分析顯示，100、150 和200 μmol/L Res處理ARPE-19細胞48 h后的凋亡率與對照組沒有差異(P>0.05)，見圖4。

Figure 2. The inhibitory effects of resveratrol on ARPE-19 cell proliferation. Mean±SD. n=15. * P<0.05, ** P<0.01 vs 0 μmol/L.

Figure 3. The effects of resveratrol on the cell cycle of ARPE-19 cells. n=9.

Figure 4. The effects of resveratrol on apoptosis of ARPE-19 cells.

5 免疫熒光檢測Res對ARPE-19細胞表達PCNA蛋白的影響

共聚焦顯微鏡下觀察，與對照組相比，150 μmol/L Res作用ARPE-19細胞48 h，胞核熒光明顯減弱，PCNA蛋白表達減少，見圖5。 這說明Res對ARPE-19細胞PCNA蛋白的表達有抑制作用。

6 Real-time PCR檢測Res對ARPE-19細胞PCNA、P21和P27 mPNA表達的影響

與對照組相比，100、150和200 μmol/L Res組PCNA mRNA表達下調(P<0.01)，且隨作用濃度的增加PCNA mRNA的表達逐漸減少；而P21和P27的mRNA表達上調(P<0.05)，且隨作用濃度的增加，P21和P27 的mRNA表達逐漸增多，見圖6。

討 論

Res是一種生物性很強的天然多酚類物質，有抗氧化、抗腫瘤、抗血小板、抗增殖等多種生物學功能，可以預防和治療動脈粥樣硬化[9]、心腦血管疾病[10]、癌癥[11]、年齡相關性黃斑病變[12]等多種疾病。關于Res抗增殖功能，抑制腫瘤細胞增殖及調節凋亡的作用和機制是目前研究的熱點，而Res對視網膜色素上皮細胞增殖影響的報道卻較少。

本實驗用不同濃度Res作用ARPE-19細胞24、48和72 h后，通過CCK-8法檢測發現Res對ARPE-19細胞的增殖有抑制作用，且在同一作用時間下，不同濃度的Res對ARPE-19細胞增殖的抑制程度不同，相同作用時間下，抑制率隨藥物濃度的增加而增強，呈現一定的濃度-效應依賴關系，同一濃度的Res對ARPE-19細胞增殖的抑制程度隨作用時間延長而增強，呈現一定的時間-效應依賴關系，150 μmol/L Res作用48 h，能使ARPE-19細胞增殖抑制率達到50%以上，與其它研究結果相同[13]。細胞增殖是一個復雜的生物學過程，其依賴于細胞周期的正常運行且涉及多個基因正常的有序表達。本實驗觀察到Res作用48 h可誘導ARPE-19細胞周期阻滯在S期，且隨藥物濃度增加S期阻滯越明顯。此外，Res各濃度組與對照組比較，對ARPE-19細胞凋亡率的影響無顯著差異，表明Res對ARPE-19細胞沒有毒性，與之前的報道一致[14]。

Figure 5. The effect of resveratrol on the protein expression of PCNA in ARPE-19 cells tested by immunofluorescence (×200).

Figure 6. The effects of resveratrol on the mRNA expression of PCNA, P21 and P27 tested by real-time PCR. Mean±SD. n=3. * P<0.05, ** P<0.01 vs 0 μmol/L.

PCNA是一種核內蛋白，是真核生物DNA聚合酶的亞單位、δ聚合酶的激活因子，通過與不同復制相關蛋白結合調節DNA復制過程，同時PCNA還通過不同調控方式與多種細胞因子作用，參與DNA損傷修復、細胞周期調控及凋亡等許多重要細胞事件，另外PCNA作為細胞增殖的指標，參與腫瘤等細胞增殖性疾病的發生發展[15-16]。通過免疫熒光方法對PCNA表達的檢測，根據PCNA的表達強弱明確DNA復制多少來確定細胞增殖的促進或抑制。實驗結果顯示Res作用組ARPE-19細胞中PCNA表達下降，表明ARPE-19增殖減慢，生長受到抑制，與CCK-8、流式結果一致。

p21基因，全稱p21WAF1/CIP1，定位于6號染色體p21.2，是p53基因的下游基因，其編碼的蛋白P21是目前所知最廣泛的細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子，可與周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)結合，使多數的cyclin-CDK復合物的激酶活性受到抑制，調控細胞周期使細胞停滯[17]。此外，P21WAF1/CIP1的羧基末端可與PCNA結合，阻止DNA全酶在DNA單鏈的滑動，從而抑制DNA的復制，調節細胞增殖，且P21蛋白可通過P53蛋白的調節間接參與DNA損傷修復過程[18]。p27基因定位于12號染色體，其編碼的蛋白質P27類似于P21，是一種廣譜CDK抑制劑，抑制cyclin D1-CDK4和cyclin E-CDK2復合物活性，對細胞周期及細胞增殖進行負性調節[19]。本實驗結果顯示，Res作用ARPE-19細胞48 h，ARPE-19細胞PCNA mRNA表達下降，而P21和P27 mRNA表達增加，呈一定的濃度依賴效應。

綜上，本研究發現100～200 μmol/L的Res作用48 h可顯著抑制ARPE-19細胞增殖，使細胞阻滯在S期，且沒有細胞毒性，其作用機制可能與上調P21和P27表達及下調PCNA表達有關。因此，Res有望成為新型抗增殖藥物，且其天然來源廣泛。但是，Res對活體眼的藥效和有無毒性反應仍需進一步實驗驗證，以期為臨床治療和預防增生性玻璃體視網膜疾病尋找新方法。

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