低劑量紫杉醇對膀胱出口部分梗阻后膀胱形態變化的影響*

王 博， 姜曉曉， 彭云鵬， 莊 巖， 孫曉青， 朱海濤

(徐州醫學院附屬醫院泌尿外科，江蘇 徐州 221002)

良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia，BPH)是老年男性常見慢性疾病，長期梗阻引起膀胱形態結構改變，即便后期減輕或解除梗阻，患者的生存質量仍難以提高[1]。目前認為此種改變與膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction，BOO)后膀胱纖維化進程密切相關。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是傳統抗腫瘤藥物，近期研究發現小劑量使用紫杉醇可能有抗纖維化作用，已有其應用于腸纖維化狹窄中的臨床報道[2]。本文通過建立大鼠BOO模型，觀察小劑量紫杉醇對膀胱出口部分梗阻后膀胱形態變化的影響。

材 料 和 方 法

1 動物

雌性Sprague-Dawley (SD) 大鼠30只，SPF級，6～8周齡，體重180～200 g，購自徐州醫學院實驗動物中心。于徐州醫學院動物實驗中心適應性飼養7 d。

2 主要試劑與儀器

紫杉醇注射液購自湖北威爾曼制藥股份有限公司。Masson染色試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。石蠟切片機(Leica)和快速低溫恒溫器(Leica)由徐州醫學院附屬醫院病理教研室提供。中性甲醛和蘇木素、尼康顯微鏡照相系統(Nikon Eclipse 80i)由江蘇省腫瘤生物治療實驗室提供。H-600透射電鏡來自Hitachi，超薄切片機來自LKB-V2088，由徐州醫學院神經生物實驗室提供。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

3 主要方法

3.1動物分組和模型建立 雌性SD大鼠隨機分為3組：空白對照組10只、BOO組10只和紫杉醇組10只。BOO組與紫杉醇組用2%戊巴比妥鈉以30 mg/kg劑量腹腔麻醉后固定，消毒。將直徑1 mm硬膜外導管插入尿道至膀胱，取下腹部正中切口，逐層分離顯露近端尿道，以導管為支架，用3-0絲線結扎尿道，松緊度以能自由移動導管同時帶動周圍組織為標準，拔出導管，縫合下腹部切口。空白對照組只在相同部位做相同手術操作，但不結扎尿道。紫杉醇組在模型建立開始，給予紫杉醇溶于生理鹽水(0.3 mg/kg)后腹腔注射[3]，每周2次。空白對照組與BOO組以等體積生理鹽水同時間腹腔注射。同等條件飼養，自由飲食。4周后，稱量體重，取膀胱，去除周圍脂肪與結締組織，用濾紙吸凈水分,稱重。

3.2HE染色 膀胱組織于10%中性甲醛中固定24～48h后，依次給予乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟，包埋制成蠟塊，切片6μm，行HE染色，光鏡下觀察膀胱肌層的增生情況。

3.3Masson染色及評價 如上切片脫蠟水化，蘇木素10 min，流水沖洗5 min，復合染液染色5 min，沖去染液，磷鉬酸1 min，沖去后滴加亮綠染液染色10 s，水速洗，置于60 ℃溫箱中烘干，封片。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析膠原纖維面積/(膠原纖維+逼尿肌的面積)比值。每張切片隨機統計5個視野后取平均值，以此比值來反應纖維化的程度。

3.4超微結構觀察 膀胱離體后立即取體部組織，切成1mm×1mm×1mm大小，2.5%戊二醛中4 ℃固定2h，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，1%鋨酸溶液固定2h，雙蒸水洗3遍，依次放入梯度乙醇、90%-無水丙酮脫水，樹脂：丙酮(1∶2)室溫下浸泡2h，樹脂：丙酮(2∶1)室溫下浸泡2h，純樹脂室溫下浸透2h，環氧樹脂(Epon812)包埋聚合后修整包埋塊，超薄切片機制作超薄切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛雙染色，H-600型透射電鏡下觀察、照相。鏡下主要觀察逼尿肌細胞、成纖維細胞細胞器及細胞間連接的改變。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比較使用S-N-K法,方差不齊時采用Dennett’s方法作多重比較。應用SPSS 13.0統計軟件處理。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠終末體重、膀胱重量及大體形態的觀察

各組大鼠體重無明顯差異[(217.00±10.46) g, (210.43±20.91) g, (212.63±11.89) g，P>0.05], 而在膀胱重量方面，BOO組[(0.376±0.052)g]明顯高于空白對照組[(0.112±0.014)g，P<0.05]，紫杉醇組[(0.215±0.025)g]低于BOO組(P<0.05)。BOO組膀胱重量與體重比值[(0.180±0.025)%]高于空白對照組[(0.052±0.006)%，P<0.05]，而紫杉醇組[(0.101±0.013)%]低于BOO組(P<0.05)。

標本大體觀察：BOO組膀胱中多出現大量渾濁尿液，抽取尿液后多殘留有泥沙樣細小結石，膀胱內壁出現明顯小梁突向腔內，厚度較空白對照組膀胱明顯增加。紫杉醇組膀胱內尿液顏色較清，較少發現結石，膀胱內壁略光滑，整體膀胱厚度較BOO組減小。

2 膀胱組織的HE染色觀察

空白對照組逼尿肌肌束排列整齊，肌束間隙中被結締組織所充滿，胞漿均勻、胞核清晰。BOO組逼尿肌肌束肥大，肌細胞數量增多排列紊亂，肌束間隙減小。相比BOO組，紫杉醇組中平滑肌增生較弱，數量略少，肌束間隙略大，見圖1。

Figure 1. Pathological changes of bladder tissues with HE staining (×400).

3 膀胱組織的Masson染色觀察

膠原纖維為藍染，主要位于黏膜下層與肌束之間，肌組織成紅色。與空白對照組相比，BOO組表現為逼尿肌增生及膠原纖維數量均增加。紫杉醇組中逼尿肌細胞略增生，但膠原纖維與BOO組比顯著減少，見圖2。

Figure 2. Pathological changes of bladder tissues with Masson staining (×400).

各組平均膠原纖維所占面積比值分別為38.94%±3.67%、29.66%±2.69%和19.94%±1.90%。與空白對照組相比，BOO組膠原纖維面積比值顯著下降(P<0.05);與BOO組相比，紫杉醇組膠原纖維面積比值顯著下降(P<0.05)，見圖3。

4 超微結構的改變

電鏡下可見空白對照組肌細胞間間隙狹窄，間隙兩側可見有高電子密度物質堆積，即肌細胞通過典型的中間連接與鄰近的細胞相連。質膜下，小泡與密斑較多。胞質內見少量線粒體，線粒體完整，形態與比例正常。胞核為橢圓形，染色質分布均勻。

BOO組中可見平滑肌外形較為肥大并且扭曲變形，肌間隙增寬，中有大量的膠原纖維蛋白，并且發現有部分類似胞漿細胞器損傷碎片脫落于間隙。細胞之間中間連接明顯減少，出現大量突起交錯，形成豐富的突觸連接與橋粒連接。肌質膜下小泡與密斑缺乏。胞漿肌絲增多，顏色較深并且走形紊亂。胞質內線粒體豐富，出現水腫，內脊減少。粗面內質網增多，功能旺盛，胞質內同時出現空泡樣變及脫顆粒現象。胞核大，分裂多見，染色質邊集，部分出現核周水腫。間質中成纖維細胞中線粒體數量增加，內質網增多擴張，核皺褶增多，功能旺盛。

Figure 3. The percentage of the collagen area [collagen/(collagen+muscle)] in the rats with different treatments. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs BOO group.

紫杉醇組中平滑肌外形略肥大，相比空白對照組肌間隙增寬，細胞之間中間連接略減少，出現略多量突觸連接與橋粒連接。胞質內線粒體略擴張，粗面內質網略增多。核膜增厚，染色質略紊亂，見圖4、5。

Figure 4. Electron micrographs of fibroblasts and collagen fibers between detrusor smooth muscle cells. The examples of collagen deposition were highlighted with the arrows (→). Slight collagen fibers were observed in sham group, a great quantity of collagen fibers existed in the interstitium in BOO group, and the intercellular space contained less collagen fibers in low-dose paclitaxel group than that in BOO group. Scale bar=500 nm.

Figure 5. Electron micrographs of intercellular junction between detrusor smooth muscle cells. Scale bar=500 nm.

討 論

BPH是一種慢性的、復雜的疾病, 雖然BPH是良性增生,但它會導致持續的尿路梗阻和下尿路刺激癥狀[4]，往往消極影響健康和生活質量。目前多針對病因行藥物或手術治療[5]，但在梗阻的后期即使消除梗阻仍然會有部分患者難以恢復正常的膀胱功能。以上這些癥狀的表現與膀胱形態結構的變化是密切相關的。Metcalfe等[6]的報道指出，BOO后膀胱的形態變化經歷炎癥滲出、逼尿肌增生和終末膀胱纖維化的過程，與此同時膀胱功能的變化也由代償轉向失功能的失代償狀態。

本實驗中梗阻后膀胱重量顯著增加，光鏡下可見明顯增生的肌細胞，黏膜下與肌束間膠原纖維增多，這些變化與Kitajima等[7]觀察是相符的。BOO組纖維面積/(膠原纖維+肌肉面積)的值相比空白對照組的值要低，提示此時期肌細胞增生比膠原纖維迅速[8]。

對超微結構形態觀察發現，BOO后肌細胞間中間連接明顯減少，出現豐富的突觸與橋粒連接。周逢海等[9]報道細胞連接方式從協同的機械偶聯轉變成局限傳播的電偶聯，此可能是引發膀胱不穩定收縮(DI)的重要原因。同時肌間隙出現大量膠原纖維，楊進益等[10]認為其富有的伸展特性使得膀胱的順應性提高，韌性增加，考慮此是BPH患者出現慢性尿潴留的基礎，而后期膠原纖維過量增多則引起膀胱順應性下降[11]，最終引起膀胱纖維化。由此可見膠原纖維過度沉積是引發膀胱功能損害的主要因素[12]。因此早期控制膠原沉積、抑制纖維化進程是保護BOO后膀胱功能的重要前提。

紫杉醇是來源于太平洋紫杉樹的樹皮提取物，是一種通過穩定微管形態調節細胞代謝活動的抗腫瘤藥物。近期研究發現小劑量紫杉醇可能在多種非癌疾病方面有治療作用,如皮膚紊亂性疾病、腎肝纖維化、抑制炎癥、保護缺血損傷和預防冠狀動脈再狹窄等[13-14]。在膠原沉積引發疾病研究中，低劑量紫杉醇多有抑制纖維化進程的作用。

瘢痕形成中[15]，局部涂抹紫杉醇能降低大鼠損傷氣道組織中成纖維細胞及炎癥細胞數量，抑制瘢痕形成。在大鼠肺纖維化模型中發現[16]，注射低劑量紫杉醇(0.6 mg/kg)能降低肺濕重與體重比例，減輕肺纖維化程度，相應細胞水平研究中Sandbo等[17]發現，紫杉醇抑制肺纖維化可能通過調控轉化生長因子β1介導的肌成纖維細胞分化實現。在大鼠單側輸尿管梗阻研究中[3]，腹腔注射低劑量紫杉醇(0.3 mg/kg，每周2次)能夠降低膠原和纖聯蛋白的表達，降低腎小管間質性纖維化程度。類似的情況還在大鼠肝纖維化、全身系統性硬化等不同領域不同器官的纖維化中有相關的報道。由此可以推測紫杉醇很有可能是治療由膠原沉積引發疾病的有用藥物。雖然低劑量紫杉醇在多種器官中有報道，但在膀胱纖維化進程中還未見此方面的相關研究。

本實驗中，與BOO組相比，紫杉醇干預后膀胱重量顯著降低，光鏡下可見肌細胞體積略小，平滑肌增生減弱，在黏膜下與肌束間膠原纖維減少，并且膠原纖維面積/(膠原纖維+肌肉面積)比值要低于BOO組，提示紫杉醇可能對BOO后膠原纖維沉積有改善作用。在超微結構方面，紫杉醇組肌間隙減小，細胞之間出現略多量突觸連接與橋粒連接，仍以中間連接為多見，肌細胞間隙內膠原纖維量減少，提示紫杉醇有可能通過形態方面影響對膀胱功能起到一定程度的保護作用。

綜上所述，BOO后膀胱出現逼尿肌增生、膠原纖維沉積、細胞連接方式改變等形態變化，使用低劑量紫杉醇后對BOO膀胱形態改變有一定程度的改善作用，這可能是通過調控細胞增生、抑制纖維合成等方式實現的。這將為我們研究BOO后膀胱損傷的發展并保護膀胱正常功能提供重要線索。另外，本實驗只是從形態學上初步探索低劑量紫杉醇對BOO后膀胱變化的影響，其內在具體分子機制以及紫杉醇使用的劑量效應關系還需進一步研究獲得。

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