獼猴B病毒gB蛋白胞外區基因片段的合成和真核表達

劉慧芳，孫書芳，曾 林，易思萌，游 穎，馬雨楠，范君文，孫兆增，王 新

(1. 軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071；2.青島農業大學，山東 青島 266109；3. 山東省青島市中心血站，山東 青島 266071)

獼猴B病毒又稱為猴皰疹病毒Ⅰ型(cercopithecine herpesvirusⅠ)，是目前發現的唯一可以感染人的動物源性皰疹病毒。感染獼猴B病毒的猴終生攜帶病原，并不定期的向外排毒傳染性較強。當病毒侵入人神經系統，治療基本失去意義[1-4]。檢測B病毒的傳統方法是病毒的分離培養及血清學實驗。由于B病毒操作的危險性、分離培養耗時較長、實驗條件要求較高，因此僅僅局限在少數實驗室進行。以B病毒作檢測抗原，由于它與人的單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)和人的單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)病毒具有較強的抗原交叉性，而難以保證檢測的準確性[5]。找到B病毒特異性抗原是對B病毒準確診斷的關鍵所在。

一般用猴子和人血清中的IgG 來作為B病毒的診斷蛋白，在評估診斷效果時，對囊膜蛋白gB，gC，gD，gE，進行比較發現gB囊膜蛋白的靈敏性和特異性都達到100%[6]。故本實驗對gB囊膜蛋白基因序列進行了合成。B病毒囊膜蛋白gB包括信號肽、胞外區、跨膜區、胞內區4個部分。獼猴B病毒囊膜蛋白蛋白的胞外區部分比胞內區和跨膜區有更好的免疫原性和反應原性，是刺激機體產生抗體的有效抗原成分[7]，故本實驗采用基因合成的方法合成胞外區部分基因序列，以便獲得重組抗原。為了新生蛋白在位于N端的信號肽的指引下到達細胞膜表面表達[8]，在gB蛋白的胞外區部分序列前加入MHC分子的Mamu-B*007:03基因序列。在合成的序列中也加入了Myc標簽的基因序列，以便于檢測gB蛋白的胞外區表達情況。

1 材料和方法

1.1 材料

獼猴B病毒合成基因(軍事醫學科學院實驗動物中心提供)，DH5α感受態細胞、質粒回收試劑盒、膠回收試劑盒、DNA Marker 2000、DNA Marker 10000、2xTaqmix購自北京博邁德生物公司。T4連接酶、限制性內切酶BamHⅠ和NotⅠ等，購自 NEB公司。轉染試劑Lipofectamine 2000購自 Invitrogen 公司。細胞培養試劑購自 Hyclone 公司。Myc標簽一抗購自AB-mart公司。辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG，購自中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 gB基因合成

從GenBank 上獲得 B 病毒的gB 蛋白胞外區序列，在序列前加入MHC分子的一段序列，使gB蛋白序列在細胞膜表面表達，然后加入信號肽序列引導該序列的表達。在序列兩端加入BamHⅠ和NotⅠ酶切位點。合成序列總長度為1762 bp,命名為gB合。然后根據gB合基因的堿基序列，設計獼猴gB合基因的鑒定引物，上游引物5’- ggcccctcgttccgcttctcctc-3’，下游引物5’- cagcttgcgggcctcgttccacag-3’，擴增片段為494 bp，以上均由北京博邁德生物有限公司合成。由于綠色熒光蛋白可能會對新構建的融合蛋白有影響，因此首先利用基因工程的方法將載體中的綠色熒光蛋白基因去掉。

1.2.2 pEGFP-N3-gB合重組質粒的構建

將合成的gB基因提取質粒，用BamHⅠ和NotⅠ進行雙酶切，對于pEGFP-N3質粒進行相同的酶切，然后用T4連接酶進行連接，連接產物轉化于DH5α感受態細胞，用PCR的方法選出陽性克隆，對于PCR陽性的質粒，利用酶切的方法進一步鑒定。

1.2.3 細胞培養和重組質粒的轉染

用含有10%胎牛血清的DMEM于37℃ 5% CO2培養箱培養293細胞，傳代于6孔板。當6孔板的密度在對數期且密度在70%，用Lipofectamine 2000 轉染重組質粒。轉染后的細胞于37℃ 5% CO2培養箱培養24～48 h，收集細胞做以下實驗。

1.2.4 Western blot 免疫印跡實驗

根據普利萊基因公司的細胞核-胞漿-胞膜制備試劑盒提取蛋白。取50 μL總蛋白進行10%SDS-PAGE蛋白電泳，然后轉移到PVDF膜上進行Western-blot檢測。對PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Myc一抗4℃搖床孵育12 h，清洗后加入山羊抗鼠的二抗，室溫孵育2 h，用TBST緩沖液清洗3次后加入發光劑顯色于暗室進行X-光片曝光、顯影。

1.2.5 細胞表達定位實驗

連續培養24 h后，利用4%多聚甲醛固定15 min對細胞進行固定，0.3%Triton X-100透化處理。加入10%的BSA封閉后再孵育myc標簽一抗，FITC(fluorescein isothiocyanate isomer I, 異硫氰酸熒光素)熒光二抗。接著用濃度為1 ug/mL的Rase(1 mL/孔)消化RNA然后加入PI，600 uL染色10 min。然后加入抗熒光猝滅封固液，固定封片，最后利用共聚焦顯微鏡，觀察、拍照。

2 結果

2.1 基因合成結果分析

利用BamHⅠ和NotⅠ對gB合基因進行酶切鑒定，得到目的片段(圖1)。基因片段大小在1000 bp～2000 bp之間，與預期結果1762 bp基本相符。

注：M：2000 DNA marker; 1:重組質粒PMD18-T-gB合的BamHⅠ和NotⅠ雙酶切結果。

2.2 pEGFP-N3-gB合重組質粒的構建結果分析

將gB合從基因合成的質粒上切下，利用T4連接酶將片段定向連接到pEGFP-N3載體。將連接后產物轉化到DH5α感受態細胞，用PCR的方法選出陽性克隆，對于PCR陽性的質粒，利用酶切的方法進一步鑒定(圖2)。

注：A(PCR) M：DNA分子量標準；1 重組質粒pEGFP-N3-GB合的PCR鑒定結果；B(酶切)M：DNA分子量標準；2 重組質粒pEGFP-N3-GB合的BamHⅠ和NotⅠ雙酶切結果。

2.3 pEGFP-N3-gB合的Western-Blot鑒定

利用Western-Blot對pEGFP-N3-gB合的表達情況進行鑒定。蛋白分子量大小預測為65.2×103，Western-Blot結果顯示目的蛋白分子量大小接近70×103(圖3)，與預期結果65.2×103基本相符。

注：1.質粒pEGFP-N3對照；2.重組質粒pEGFP-N3-gB合的蛋白表達，M，低分子量蛋白質標準。

2.4 pEGFP-N3-gB合在細胞內的定位表達

對含有Myc標簽的pEGFP-N3-gB合重組質粒轉染到293細胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發現myc標記的蛋白發出明亮的綠色熒光，細胞核為紅色球形(圖4，彩插2)。進一步觀察重組蛋白在細胞內的定位情況進行研究發現，重組蛋白在細胞膜上表達，這與預期加入MHC分子引導序列在細胞膜上的表達相一致。

3 討論

隨著對獼猴B病毒結構的研究不斷深入，特別是獼猴B病毒的全基因組測序的完成，囊膜糖蛋白(glycoprotein)逐漸成為獼猴B病毒診斷和防治研究的主要靶點。國內已利用基因工程技術產生獼猴B病毒囊膜重組蛋白，隋麗華等[9]，利用原核表達系統產生gB蛋白特異性表位重組抗原，嚴翔等[10]用桿狀病毒作為表達載體構建了gB合成基因的桿狀病毒質粒。段博芳等[11]用獼猴B病毒gB基因在昆蟲細胞中表達，以上證實重組蛋白具有較好的抗原性。

為了進一步觀察gB重組蛋白的在細胞內的表達情況，本實驗合成gB胞外區基因，構建了pEGFP-N3-GB合重組質粒，在真核細胞中進行表達并觀察在細胞內的定位情況。結果顯示，pEGFP-N3-GB合重組質粒在細胞內高效表達，利用亞細胞定位技術證明了gB蛋白的胞外區基因序列能在細胞膜表面高效表達重組蛋白，為獲得獼猴B病毒靈敏性和特異性較好的重組蛋白提供好的方法，為下一步檢測試劑盒的制備奠定的基礎。

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[11] 段博芳，王瓊，鍛綱，等. 猴B病毒gB基因在昆蟲細胞中的表達[J].中國人獸共患病學報，2012，28(7)：674-678.