熒光定量RCR檢測比格犬雌激素β受體mRNA在間情期與發情期表達量的差異

鐘 睿，甘 藝，任秀梅，許 琴，趙彥斌，劉 冰，孫兆增，朱宇旌，欒新紅，胡仲明，張 勇，曾 林

(1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，沈陽 110866；2.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071；3.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319)

比格犬廣泛的應用于各種醫學科研, 是國內外公認的實驗犬[1]。本實驗室對比格犬的生殖生理進行了一定的基礎研究[2]。但近期其種群中出現了不發情、休情期延長等情況，影響了這一種群的繁衍，也影響了實驗動物的生產供應。動物發情主要受下丘腦、垂體以及激素調控，而雌激素又在調節過程中起著重要作用，因此研究雌激素在發情周期中的變化情況就顯得舉足輕重了。發情周期分為發情前期、發情期、發情后期和間情期，然而本實驗組旨在探究ERβ基因在發情周期中的變化情況，并不是要細化各個發情周期，因此將發情周期簡化為發情期和間情期，這樣也便于對基因進行定量。

雌激素像其他激素一樣能夠誘導很多生理反應，這些作為調解功能的受體從1960年開始就一直受到關注。1986年雌激素受體被克隆出來[1]，并在小鼠的很多器官系統中發現了其預期中的顯型[2]，一時間得出的結論是僅有這一種雌激素存在。然而1996年，Jan-Ake Gustafsson[3]在重要的學術報告會上宣稱他的團隊已經發現了雌激素的第二種形式，從而最先克隆出來的受體被命名為ERα，第二種受體被命名為ERβ，ERβ基因是在應用大鼠前列腺cDNA和PCR退火引物探索雄激素受體額外作用的過程中發現的。一直以來，都有人不斷的研究ERβmRNA在組織中的表達量，但對比格犬的研究相對較少，因此本實驗應用實時熒光定量PCR技術(QRT-PCR)探究ERβmRNA在間情期和發情期比格犬卵巢、子宮、垂體、下丘腦內的表達情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

比格犬12只，發情期比格犬和間情期比格犬各6只，軍事醫學科學院實驗動物中心提供【SCXK(軍)2002-001】。

1.2 儀器和材料

pEGFP-N1-ERβ重組質粒，由本實驗組構建，TRIZOL購自Invitrogen公司，DEPC購自Promega公司，反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)和SYBR? Premix Ex TaqTMII購自TaKaRa公司，Real Time PCR擴增儀(BIO-RAD iQTM5)。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA提取及RT-PCR

參照Trizol試劑盒方法[4]提取比格犬下丘腦、垂體、卵巢和子宮中的RNA，依據反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，反應體系為：5×PrimeScript Buffer 4 uL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1 uL，Oligo dT Primer 1 uL，Random 6 mers 1 uL，Total RNA 5uL，RNase Free H2O加至20 uL。反應條件為：37℃ 30 min；85℃ 5 s；4℃保存。

1.3.2 合成引物

根據GenBank 中比格犬的ERβ(XM_861041.2)和β-actin(AF021873)基因序列，利用primer premier 5.0軟件進行引物設計，ERβ基因上下游引物序列分別為：5’-tctcccttagccatccattg-3‘和5’-gcatccctctttgaacttgg-3’, 擴增產物長度為179 bp；內參基因β-actin上下游引物序列分別為：5’-cctgtcttacccaatgttttcc-3‘和5’-gcagcactttattttcctcacac-3’，擴增產物長度為235 bp，引物送至上海生物工程有限公司合成。

1.3.3 QRT-PCR

制作標準曲線：以pEGFP-N1-ERβ為模板，按照十倍濃度梯度稀釋6個濃度標準，按照預先篩選好的反應條件及反應體系進行擴增。擴增體系：SYBR?PremixExTaqTMII 12.5 uL，上游引物1 uL，下游引物1 uL，cDNA模板1 uL，滅菌蒸餾水加至25 uL。擴增條件：預變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火58℃/63℃(β-actin/ ERβ)20 s，循環40次；熔解曲線為95℃ 1 min；55℃ 1 min；55℃循環133次(每隔0.3℃采集一次熒光信號)，到94.6℃,通過熔解曲線對熒光定量PCR產物進行特異性分析[5]。所有的樣品都在反應孔中做3次重復。所得數據經iQ5自帶的軟件進行分析整理。

2 結果

2.1 QRT-PCR結果

標準曲線結果顯示ERβ和內參基因β-actin相關系數R2均大于0.98，說明結果具有可信度；擴增效率分別為98.4%和100%，都在80%～120%之間，而且非常接近1，擴增效率理想。內參基因β-actin(A)和ERβ基因(B)的標準曲線如圖1所示：

此外，R2(β-actin)-R2(ERβ)< 0.1，所以可以通過2- ΔΔCT方法對目的基因進行相對定量。擴增曲線與熔解曲線表明目的基因及內參基因沒有產生非特異性擴增及引物二聚體，可作分析使用。內參基因β-actin(A)和ERβ基因(B)的擴增曲線如圖2所示：

內參基因β-actin(A)和ERβ基因(B)的熔解曲線如圖3所示：

2.2 比格犬卵巢、子宮、垂體、下丘腦中ERβmRNA的相對定量結果

運用2-△△CT法進行定量，即△CT目的基因=CT目的基因-CT內參基因，△△CT=△CT間情期ERβ基因-△CT發情期ERβ基因[6]，ERβmRNA表達差別以2-△△CT表示。間情期的比格犬卵巢、子宮、垂體、下丘腦內ERβ基因mRNA的表達量是發情期的比格犬卵巢、子宮、垂體、下丘腦內ERβ基因mRNA的表達量的0.35倍、0.17倍、0.44倍、0.43倍，如圖4所示：

圖1 ERβ和β-actin基因的標準曲線

圖2 β-actin和ERβ基因的擴增曲線

注：A：卵巢內ERβmRNA的定量結果；B：子宮內ERβmRNA的定量結果；C：垂體內ERβmRNA的定量結果；D：下丘腦內ERβmRNA的定量結果。

圖5 雌激素調控發情的機制

3 討論

犬類是一次發情的物種，隨著一段單一發情階段會有幾個月性活動不活躍。這些繁殖周期根據下丘腦-垂體-卵巢軸受著內分泌調控。可是，調控雌犬循環往復的發情的確切機制還不清楚。現如今，另一種ER子類型，ERβ，從大鼠前列腺被克隆出來；ERβ蛋白對雌激素有著高親和性。但是，沒有針對犬類組織中cDNA序列和ERβ的表達的相關資料。ERβmRNA主要分布在大鼠粒層細胞內，說明ERβ可能對粒層細胞增殖起著重要作用。現如今的研究表明ERβmRNA水平較之間情期早期在間情期末期有著顯著的提高；此外，ERβmRNA水平與血漿中E2水平呈正相關，這可能暗示犬卵巢內的ERβ是與卵泡生長和卵巢反應力相聯系的[7]。雌激素調控發情的機制如圖5所示：

如圖所示，ERβ既在細胞質內起作用，又在細胞核內起作用，發情期起始雌二醇進入細胞質內與ERβ結合形成E2-ERβ復合體，E2-ERβ復合體又與效應器蛋白相結合，引起信號級聯，隨后激活細胞質內激酶，之后會引起細胞核內E2-ERβ復合體與輔表達蛋白結合在雌激素反應元件上起作用，還會直接作用于轉錄因子，再在反應元件上起作用，也會使結合著輔表達蛋白的E2-ERβ復合體與轉錄因子結合，然后在反應元件上起作用，以這種方式復制的mRNA翻譯成的蛋白質會引起細胞內一系列反應，反應的結果使得在發情期ERβ的含量較間情期增多，也就是本實驗的熒光定量所顯示的結果。

參考文獻：

[1] 孫兆增，曾林，洪寶慶，等．乙烯雌酚對間情期比格犬發情的誘導[J]．中國比較醫學雜志，2008，18( 11) : 36 -43．

[2] 孔德強，李愛學，曾林，等．一種比格犬雌二醇β受體剪切異構體的克隆和序列分析[J]． 中國比較醫學雜志，2011，21(7) : 44 -47.

[3] Greene GL, Gilna P, Waterfield M,etal. Sequence and expression of human estrogen receptor complementary DNA[J]. Science, 1986, 231: 1150-1154.

[4] Lubahn DB, Moyer JS, Golding TS,etal. Alteration of reproductive function but not prenatal sexual development after insertional disruption of the mouse estrogen receptor gene[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993, 90: 11162-11166.

[5] Kuiper DDJM, Enmark E, Pelto-Huikko M,etal. Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93: 5925-5930.

[6] 趙彥斌，孫兆增，曾林，等．黑線倉鼠及其白化突變系 TYR、TYRP1的基因表達水平比較分析[J]. 中國比較醫學雜志，2012，22(7)：1-4.

[7] Shingo H, Ryuzo T, Daijiro K,etal. Expression of estrogen receptor α and β genes in the mediobasal[J]. Neuroscience Letters, 2003, 347: 131-135.