猴B病毒囊膜蛋白gD的B細胞表位預測及鑒定

葉華虎，袁菊芳，劉 歡，范玉筠

(1.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071；2.北京城市學院，北京 100094)

表位(epitope)又稱抗原決定簇(antigenic determinant, AD)，是病毒、疫苗、致敏原等抗原物質刺激機體產生免疫應答的物質基礎。現代免疫學研究表明，免疫細胞在與抗原分子的相互作用過程中，細胞表面受體識別的不是整個抗原分子，而是抗原分子上的特定部位(包括線性的，或是空間結構上相互靠近的多個氨基酸殘基)[1-2]。可見，由異源蛋白活化B淋巴細胞產生的抗體僅針對抗原上的特異性表位。隨著抗體在疾病診斷、預防、治療等領域的廣泛應用，表位鑒定已成為免疫學研究的熱點。

到目前為止，表位研究已形成了多種技術體系，如噬菌體展示肽庫技術、肽段掃面技術、合成肽技術、生物信息學預測技術。相較于其他技術體系，生物信息學預測技術具有快速、廉價等明顯優勢[3-5]。本實驗以在我國恒河猴體內擴增的B病毒囊膜蛋白gD氨基酸序列為基礎，利用生物信息學軟件對其二級結構、親水性、表面可及性、抗原性指數、柔韌性進行分析，篩選可能的表位肽段，再結合合成肽技術，利用B病毒陽性血清通過ELISA進行驗證；最后，以20份B病毒標準陽性血清評價肽段的敏感性。本實驗旨在為猴B病毒的防控研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 gD蛋白 系從我國實驗獼猴體內通過PCR擴增得到的gD基因推導而來，其氨基酸序列如下：該蛋白全長394個氨基酸殘基，分子量約為48×103，與E2490標準毒株的同源性為97.5%。

1MGSGIAAVLL SLAVALARVP AGGGEYVPVE RSLTRVNPGR FRGAHLPPLE QKTDPPDVRR VYHVQPFVEN PFQTPSVPVAV YYAVLERAC RSVLLWAPTE AVQVVRGAPE ATRSDARYNL TVAWYRTSDD CAIPILVMEY AECQYDKPLG ACPVRNLPRW SFYDSFSATG DDDLGLLMHA PAFETAGTYV RLVKVNGWVE VTQFIFEHRG KGPCRYTLPL RILPAACLRA PVFEQGVTVD AIGMLPRFIP ENQRIVAVYS LQAAGWHGPK APFTSTLLPP EVVETANVTR PELAPEERGT SRTPGDEPAP AVAAQLPPNW HVPEASDVTI QGPAPAPSGH TGAVVGALAG AGLAAGVVVL AVYLVRRRGR AAGKHVRLPE LLEEAHGPAR RGAPY394

1.1.2 血清和抗體 B病毒陽性血清和B病毒陰性血清，軍事醫學科學院實驗動物中心保存。

1.1.3 ELISA檢測試劑 氨基酶標板購于Nunc公司；其他ELISA試劑為湖州英創生物公司產品。

1.1.4 主要儀器 脫色搖床，恒溫水浴鍋，酶標儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 B病毒囊膜蛋白gD二級結構預測 利用DNAStar軟件，以Chou-Fasman方法、Karplus-Schulz方法和Gamier-Robson方法對預測gD蛋白的二級結構[6]。

1.2.2 猴B病毒囊膜蛋白gD基因B細胞表位預測 利用DNAstar軟件，用Jameson-Wolf方法對猴B病毒囊膜蛋白gD基因氨基酸序列抗原性指數區域預測[7]；用Emini方法猴B病毒囊膜蛋白gD基因氨基酸序列表面可及性區域預測[8]，用Kyte-Doolittle方法對猴B病毒囊膜蛋白gD基因氨基酸序列親水性預測[8-10]。綜合分析將上述幾種方法，兼顧各項預測參數對猴B病毒囊膜蛋白gD基因 B細胞表位進行預測，并以吳玉章建立的抗原性指數對預測的表位進行綜合評判[11]。

1.2.3 肽段合成 將預測的肽段送南京金斯瑞生物技術有限公司合成。

1.2.4 肽段ELIS條件優化 首先以文獻報道的已知表位肽(AVYLVRRRGR)為基礎進行ELISA條件優化，過程簡述如下：將合成肽段用滅菌的PBS稀釋成1 mg/mL，再用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋成不同濃度，稀釋液用于包被氨基板；將包被過夜的ELISA板用PBS洗滌3次，加100 μL封閉液(博邁德生物技術公司)于37℃封閉30 min；將5份標準陽性血清混合物和3份標準陰性血清混合物分別作5、10、20倍稀釋，加入酶標板，在37℃反應35 min；5×3 min洗滌；再加入100 μL二抗反應液(用封閉液稀釋HRP標記的兔抗猴IgG到30000倍)，37℃反應35 min；5×3 min洗滌；再加入TMB顯色液100 μL，37℃反應，8 min；最后加入50 μL的2N H2SO4終止顯色；酶標儀上測定450 nm下的OD值。比較不同條件(包被量和血清稀釋倍數)下的信噪比(P/N值)，確定ELISA的包被量和血清稀釋比例。

1.2.5 gD表位鑒定 將7個預測得到表位肽段按優化確定的結果進行稀釋和包被，并以上述血清進行ELISA初步鑒定，ELISA結果判定：以陰性血清的OD值的2倍作為陽性判定結果。

1.2.6 不同表位的敏感性和特異性評價 對于初步鑒定為表位的肽段，用20份B病毒標準陽性血清和10份B病毒陰性血清評價其敏感性和特異性。

2 結果

2.1 B病毒囊膜糖蛋白gD基因二級結構預測

利用G Gamier-Robson法和Chou-Fasman法分別對猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的α-螺旋區域、β-折疊區域、轉角區域和柔性結構區域進行預測(圖1～圖4)。綜合分析比較兩種方法的預測結果，得出最優效果。

2.2 猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因B細胞表位預測

利用Jameson-Wolf方法對猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因抗原性指數(抗原性指數≥0)進行預測(圖5)；利用Emini方法對猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因表面可及性區域(表面可及性指數≥1)進行預測(圖6)；利用Kyte-Doolittle方法對猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因親水性區域(親水性指數≥0)進行預測(圖7)。

篩選出具有較好抗原性指數、表面可及性和親水性且在二級結構上含有易形成不規則卷曲結構和抗原表位轉角的區段，這些區段極有可能成為B細胞表位。結果顯示猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因N端第26-34、46-54、106-116、122-130、203-214、291-306、361-370區段的抗原性指數最高，提示在這些區段是B細胞表位的可能性最大(表1)。

圖1 猴B病毒囊膜糖蛋白gD α-螺旋和β-折疊區域預測結果

圖2 猴B病毒囊膜糖蛋白gD轉角區域預測結果

圖3 猴B病毒囊膜糖蛋白gD無規則卷曲區域預測結果

圖4 猴B病毒囊膜糖蛋白gD柔性區域預測結果

圖5 猴B病毒囊膜糖蛋白gD抗原性指數預測結果

圖6 猴B病毒囊膜糖蛋白gD表面可及性預測結果

圖7 猴B病毒囊膜糖蛋白gD親水性預測結果

表1猴B病毒囊膜糖蛋白gD的表位預測結果

Tab.1Prediction of B-cell epitopes on Monkey B virus envelope protein gD

B細胞表位區域Domains of B-cell epitope氨基酸序列Amino acid sequences of epitopes26-34YVPVERSLT46-54LPPLEQKTD106-116RGAPEATRSDA122-130VAWYRTSDD203-214QFIFEHRGKGPC291-306PELAPEERGTSRTPGD361-370AVYLVRRRGR

2.3 合成肽的ELISA檢測方法建立

由于合成肽可能與重組蛋白不完全一致。實驗先用被證實是B病毒表位肽段的AVYLVRRRGR(位于gD蛋白的361-370)為對象，分別用濃度100、150和300 ng每孔包板，并以5份標準B病毒陽性血清的混合物和3份標準陰性血清進行檢測(3次重復)。其中血清稀釋倍數分別為1∶5、1∶10和1∶20，兔抗猴IgG-HRP的稀釋濃度為1∶30000。ELISA的OD值閾值為3份陰性血清平均OD的2倍。

結果顯示：肽段以150 ng每孔包被，血清稀釋比例為1∶5的反應條件最好，此時信噪比最高，且結果重復性好(表2)。

2.4 gD表位鑒定

將7個肽段(表1)按照150 ng每孔包板，對5份陽性血清的混合物和3份陰性血清進行ELISA檢測，血清稀釋比例為1∶5，兔抗猴IgG-HRP工作濃度為1∶30000，OD值閾值為3份陰性樣本的平均OD值乘以2 倍。結果顯示，gD蛋白上的4個肽段(46LPPLEQKTD54、106RGAPEATRSDA116、291PELAPE ERGTSRTPGD306和361AVYLVRRRGR370)都能與B病毒陽性血清反應反應，且OD值均顯示為陽性(表3)。其余肽段均為陰性，即使將這些肽段的包被量提高到300 ng每孔，在其他ELISA參數不變的情況下，結果仍為陰性。表明這些肽段不是B病毒的表位。

表2 肽段ELISA參數的優化

表3 ELISA方法鑒定的表位肽段

圖8 表位肽與20份陽性血清的ELISA檢測結果(紅色表示陽性，白色表示陰性)

2.5 不同表位的敏感性和特異性評價

將上述表位肽段按150 ng每孔包被，分別用20份B病毒標準陽性血清和10份標準陰性血清鑒定各表位的敏感性和特異性。其中，血清稀釋比例為1∶5，兔抗猴IgG-HRP工作濃度為1∶30000，OD值閾值為3份陰性樣本的平均OD值乘以2 倍。結果顯示，各個肽段都不與陰性血清發生反應，特異性為100%；但就敏感性而言，不同表位肽段各不相同，106RGAPEATRSDA116肽段的敏感性最低，僅能與20份陽性血清的8份(40.0%)發生反應，而361AVYLVRRRGR370)能與20份陽性血清中的14份(70.0%)發生反應，其他肽段的敏感性位于二者之間。

比較7個表位肽段與20份陽性血清的反應性發現，有些表位肽段的陽性樣本完全一致，有些表位肽段的陽性樣本只是其他表位的一部分，也有一些表位的陽性樣本之間有交叉，但也有一些陽性樣本在所有表位中均呈陰性表現(圖8)。

3 討論

對于抗原表位的研究策略，人們已建立和發展了多種方法，如噬菌體展示肽庫技術、但克隆抗體篩選技術、肽探針掃描技術和基于生物信息學的表位預測技術等[1-5]。其中表位預測因其簡單和廉價而越來越受到研究者重視，該方法既克服了肽探針掃描需要大量肽段合成所帶來的高成本，也避免了化學和生物學方法以及噬菌體隨機肽庫展示技術所要求單克隆抗體。同時該方法也是當前廣泛采用的，并被證明是行之有效的表位研究技術[3-5]。

表位預測主要依據蛋白質的二級結構、親水性、表面可及性、抗原性指數以及柔韌性等參數，預測抗原的表位序列。目前開發的分析軟件正是基于不同參數組合形成的數據庫，因而預測的結果可能有較大差異，且都存在預測失誤(包括漏測和錯測)等缺陷。有研究者統計，目前建立的表位預測技術，準確率通常在15%～75%之間[12-13]。

我們分別利用了在線預測軟件，如ABCpred(ABCpred 采用人工神經網絡來預測線性表位，從Bcipep 和SwissProt 數據庫中提取非冗余的表位肽和非表位肽作為訓練集，采用5- 折交叉驗證，預測敏感性約為67%，特異性約為64%[14])、BepiPred(BepiPred 結合氨基酸的性質，如親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉角和隱形馬爾可夫模型來預測線性表位，預測結果表明，同那些僅依賴于氨基酸性質的預測方法相比，BepiPred 預測結果的準確性有一定程度的提高[15])、APP(基于氨基酸通常成對出現在抗原表位的頻率要比其出現在非表位肽段的頻率高并聯合支持向量機[16])等算法，同時結合國內一些學者創建的軟件進行預測。綜合這些軟件的預測結果，在B病毒囊膜gD上得到7個可能的表位肽段。其中，預測得到的gD蛋白上的361AVYLVRRRGR370表位，已被實驗所證實，二者的差異僅為1個氨基酸殘基，即實驗鑒定的表位為的362VYLVRRRGR370[17]。

對7個肽段的鑒定結果顯示， 4個肽段都能與B病毒的陽性血清發生反應，表明這4個片段是B病毒的表位。對與B病毒高度同源的HSV-1囊膜蛋白gD功能研究發現，胞外區1-32個氨基酸殘基、Y38、D215、R222、F223是受體的結合區，負責與受體結合；胞外區280-302個氨基酸殘基為柔性折疊部位，負責維持gD構象；胞外區C端是gB、gL/gH的結合部位，負責膜融合[18-20]。如果B病毒的gD蛋白采用與HSV-1相似的功能機制，那么在本實驗中鑒定的3個表位(分別為46LPPLEQKTD54、106RGAPEATRSDA116和291PELAPEERGTSRTPGD306)將與功能區重合或與功能區緊密相連。這為前期文獻報道—以gD基因為基礎的核酸疫苗能較好保護免疫動物提供了合理解釋[21-22]。

實驗進一步利用20份B病毒陽性血清對4個表位進行了評價，發現表位肽與血清的反應性不完全一致。其中，106RGAPEATRSDA116肽段的敏感性最低，僅能與20份陽性血清的8份(40.0%)發生反應，而已被證實的表位361AVYLVRRRGR370，敏感性為70%，與其他文獻報道的67%相似[22]。將多個具有互補作用的表位串聯，形成嵌合性多價表位蛋白/疫苗，作為檢測抗原的敏感性和/或作為疫苗的保護作用明顯增強，已在其他研究中得到證實[23-24]。將上述表位進行聯合或者重組，是否有利于提高檢測的敏感性和疫苗保護效果，有待于進一步研究。

總之，本實驗利用生物信息學方法在B病毒囊膜蛋白gD上鑒定了4個表位，這些表位的發現，為進一步開展B病毒感染機制研究以及快速檢測方法的建立奠定了基礎。

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