胃癌相關mir-148a靶向調控胃泌素受體CCKBR

郭水龍，朱圣韜，李 鵬,3，王擁軍,3，王 民，邢 潔，郭慶東，孫秀梅，張澍田,3

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院，北京 100050；2. 消化疾病癌前病變北京市重點實驗室，北京 100050；3.北京市消化疾病中心，北京 100050 )

胃癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤，名列全球第二大癌癥死亡原因[1]。我國是胃癌高發國，每年新發胃癌患者40萬人，發病率在所有惡性腫瘤居首位，死亡人數達30萬人，約占所有惡性腫瘤死亡人數的25%～30%[2]。胃泌素受體(也稱膽囊收縮素B受體，CCKBR)是生長因子胃泌素(Gastrin)的重要受體， 主要分布于在胃體黏膜的壁細胞和ECL細胞。生理上，CCKBR主要通過與Gastrin結合，調節胃液、胃蛋白酶和膽汁的分泌[3]。近年來的研究發現，Gastrin及其受體CCKBR與胃腸道腫瘤尤其是胃癌的發生密切相關，可作為胃癌早期診斷的重要指標，并可能發展成為胃癌治療的靶位點[4-5]。miR-148a是最早發現，同時也是最重要的胃癌相關microRNA之一，但目前對其在胃癌中的作用機制還不十分明確[6]。本研究從多個方面證實miR-148a可以靶向CCKBR，揭示了二者參與胃癌發生發展的新的功能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

真核表達載體pIRES2-EGFP購自BD公司，miR-148a Luciferase報告載體pGL3-CM 由pGL3-control改構。BGC-823和293T細胞由本實驗室保存。CCKBR抗體購自Abcom公司，

GAPDH抗體和二抗購自中杉金橋公司。各種限制性內切酶和T4多聚核苷酸激酶購自NEB公司。引物和探針合成自Invitrogen公司。質粒抽提及凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司，轉染試劑購自Invitrogen公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司，其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 miR-148a靶向CCKBR的生物信息學預測：使用microRNA在線靶點分析工具TargetScan(www.targetscan.org)分析人CCKBR基因3’UTR，發現3處miR-148a的潛在結合位點，分別位于第334、423和476堿基處(圖1)。可以看出，miR-148a與CCKBR之間存在很好的靶向關系。

1.2.2 miR-148a真核表達載體的構建：合成miR-148a上下游引物，序列分別為5′- aaaagatctgaacacac ctgcaggaagaa-3′和5′- aaaaaagcttctggcgtctggagcactg-3′，PCR擴增出164 bp的產物序列。PCR產物經切膠回收和連接，插入pIRES2-EGFP真核表達質粒。挑陽性克隆進行測序鑒定。

1.2.3 miR-148a過表達的Northern Blot檢測：miR-148a轉染細胞后24 h提取細胞RNA，根據文獻描述方法進行Northern Blot檢測，上樣量為20 μg[7]。 miR-148a探針序列為其完全互補序列，使用T4多聚核苷酸激酶將32P 標記5’末端。

1.2.4 熒光素酶活性檢測miR-148a對CCKBR 3’UTR的靶向作用： 使用上下游引物5′-ccgctcgagg gttgaggcagggcaaatgac-3′和5′-ccgacgcgtttgggtaaggaagg agagggc-3′ 擴增人CCKBR的3′UTR，并克隆到 pGL3-CM質粒構建熒光素酶報告載體(野生型)。采用引物5′-ccggaattcattgttttaga gactatggagc-3′和5′-ccggaattccattaatctatgtgtgtgag agg-3′；5′-ccggaattcaaaa taccatcaggcctaatc-3′和5′-ccggaatt ctgattgggaagggtcactgt -3′；5′-ccggaattcaaaaggttcttcatccct ttcc-3′和5′-ccggaattcagaacagcctgttggtcaga-3′分別將CCKBR 3′UTR的 334、423和476三處miR-148a潛在結合位點進行突變，構建熒光素酶報告載體(突變型)。將報告載體與miR-148a過表達載體共轉染細胞，48 h后裂解細胞，根據試劑說明書進行檢測。檢測儀器為LB 960 Centro XS3 luminometer。

1.2.5 Western Blot蛋白檢測：使用RIPA裂解細胞提取蛋白并檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，上樣量為25 ～ 50 μg。半干法轉膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗(1∶1000)4℃孵育過夜，HRP偶聯二抗室溫孵育1 h，ECL發光顯影。

1.2.6 統計學分析 采用 SPSS 10進行統計分析，數值采用均數±標準差表示，組間數據比較采用t檢驗，P< 0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-148a真核表達載體的構建

圖1 人CCKBR 3’UTR 上miR-148a結合位點預測

將構建的miR-148a表達載體(IE-148a)進行測序，結果顯示 164 bp的擴增產物(miR-148a前體)正確插入載體中，序列與pubmed數據庫完全一致。Northern Blot檢測miR-148a載體在BGC-823細胞中的表達(圖2)，與空載體Vector相比，過表達組miR-148a的表達量明顯增加，證實構建的載體能夠在真核細胞中過表達miR-148a，適合下一步實驗使用。

圖2 Northern Blot 檢測miR-148a真核載體表達

2.2 miR-148a通過與3’UTR 423 bp處的靶位點結合，抑制人CCKBR基因的表達

熒光素酶活性檢測結果顯示(圖3)，miR-148a過表達可以明顯抑制含CCKBR 3’UTR報告載體的熒光素酶活性，大約為空載體對照組的64%(P< 0.05)，表明miR-148a通過結合3’UTR區可抑制CCKBR基因的表達。當分別將三個預測的miR-148a結合位點突變后，3’UTR 423 bp處的突變可顯著消除miR-148a過表達導致的熒光素酶活性降低(P> 0.05)。而3’UTR 334 bp和476 bp處的結合位點突變沒有此效應(P< 0.05)，與野生型報告載體的熒光素酶活性相同。結果表明，miR-148a通過與CCKBR 3’UTR 334 bp處結合，直接抑制該基因的表達。

圖3 熒光素酶活性分析檢測各組報告載體表達(*P < 0.05)

2.3 miR-148a抑制CCKBR蛋白表達

Western Blot結果顯示，如圖4，與空白對照和空載體Vector相比，miR-148a過表達可顯著抑制胃癌細胞BGC-823中CCKBR的蛋白表達。

圖4 Western Blot檢測各組細胞CCKBR蛋白表達

3 討論

胃泌素主要由分布于胃竇和十二指腸近端的G細胞分泌，通過與受體結合調節胃酸和組胺的分泌來發揮作用。胃泌素在胃中作用的主要靶點是胃體黏膜的壁細胞和腸嗜鉻樣細胞(ECL)細胞表面分布的受體CCKBR。小鼠胃CCKBR基因敲除導致ECL細胞減少，胃壁變薄[8]。近年來胃泌素及其受體CCKBR在消化道腫瘤及其癌前病變中的作用越來越引起人們重視。研究證實，胃癌患者胃癌組織中CCKBR的含量明顯高于對照正常組織，胃泌素及CCKBR廣泛參與胃癌發生發展[4,9-10]。Cui等[11]發現高胃泌素血癥的日本綿鼠發生胃癌，該胃癌起源于ECL細胞，而CCKBR拮抗劑YF476可阻止高胃泌素引起的胃癌發生[12]。雖然CCKBR在胃癌發展過程中表達逐漸升高，但其異常表達的機制至今不是十分明確。

microRNA (miRNA)是一類22 bp左右的非編碼小RNA，通過序列互補與特異mRNA結合，在轉錄后水平調控靶基因的表達。我們前期的工作和眾多研究組研究結果表明，miR-148a在人胃癌組織中表達下調，并通過作用于不同的靶分子調控胃癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等[13-17]，是重要的胃癌抑制miRNAs之一。我們前期對miR-148a在胃黏膜中的表達定位研究結果顯示，miR-148a主要分布于小鼠胃黏膜底部，這一位置主要為壁細胞和ECL細胞等分泌細胞，提示miR-148a可能參與調控胃黏膜的分泌功能[14]。此外，我們前期研究還發現，miR-148a下調是胃癌發生的早期事件，胃癌小鼠模型胃組織中miR-148a在小鼠出生20 d后即觀察到50%的下調，60 d后下調約80%[18]，這與胃癌發展過程中CCKBR的逐漸上升是同步的，提示二者之間可能存在調控關系。本研究中，我們首先通過信息學預測，在CCKBR中發現了3個miR-148a的結合位點。然后，通過構建的miR-148a真核表達載體并在胃癌細胞中過表達，我們證明miR-148a可直接與CCKBR的3’UTR結合，抑制其基因表達和蛋白翻譯。這一發現，為CCKBR表達調控機制和miR-148a在胃癌中的作用機制提供了新的解釋。

目前，國內外研究者都在開發新的胃癌早期診斷標志物和藥物作用靶點，而胃泌素及其受體和miRNA是其中的兩大熱點[9,19-21]。本研究的結果為胃癌早期篩查和治療提供了新的潛在靶分子，并為下一步的臨床研究奠定了基礎。

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