新型禽源人流感病毒(H7N9)的小鼠感染模型和傳播模型建立

陳 霆，鮑琳琳，朱 華，鄧 巍，許黎黎，呂 琦，李楓棣，秦 川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

首次人感染禽源甲型流感病毒(H7N9株)報(bào)道發(fā)表于2013年3月[1]。該新型病毒的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(N)基因可能起源于歐亞禽流感病毒，而其余的基因與H9N2型禽流感病毒密切相關(guān)[2]。這一重組流感病毒會(huì)對(duì)人類(lèi)造成嚴(yán)重甚至致死性的呼吸系統(tǒng)疾病。報(bào)告顯示，138個(gè)感染者中37人死亡。大多數(shù)患者有活禽接觸史，提示該病毒可以通過(guò)家禽對(duì)人跨物種進(jìn)行傳播[3]。在2003年荷蘭爆發(fā)的H7N7疫情中發(fā)現(xiàn)，病毒的人際傳播十分有限。然而，曾被報(bào)道的三宗疑似家庭病例群集也應(yīng)引起人們的重視，這表明對(duì)于H7N9病毒在哺乳動(dòng)物中的感染性、毒力研究以及傳播力的研究十分重要。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株：病毒株為H7N9 (strain A/Anhui/1/2013)，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心流感中心贈(zèng)予。該病毒株序列與全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織(GISAID)的流感序列數(shù)據(jù)庫(kù)中No.EPI439503和No.EPI439510的序列一致。

1.1.2 動(dòng)物：雌性5周齡無(wú)特定病原體BALB/c小鼠，由來(lái)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001)。所有操作經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有的感染實(shí)驗(yàn)均在A(yíng)BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，批號(hào)ILAS-PC-2013-007。

1.2 方法

1.2.1 LD50測(cè)定

通過(guò)鼻內(nèi)感染小鼠測(cè)定H7N9(A/Anhui/1/2013)的半數(shù)致死量(LD50)。H5N1病毒(A/SZ/406H/06)和H1N1病毒(A/CA/07/09)作為對(duì)照。

1.2.2 小鼠感染實(shí)驗(yàn)

每只接種106TCID50病毒感染小鼠，通過(guò)MDCK細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 小鼠直接接觸感染實(shí)驗(yàn)

采用直接接觸小鼠模型來(lái)探索新型H7N9病毒的傳播能力。將7只健康小鼠與3只感染24后小鼠(106TCID50經(jīng)鼻感染)同籠飼養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 H7N9病毒在小鼠體內(nèi)毒力檢測(cè)

三種病毒的LD50分別為107.5 TCID 50(H7N9)、101TCID50(H5N1)及104.8TCID50(H1N1)(彩插11圖1a)。

當(dāng)接種劑量為106TCID 50時(shí)，感染H5N1或H1N1病毒的小鼠在觀(guān)察期內(nèi)死亡，但感染H7N9病毒的小鼠未觀(guān)察到死亡(彩插11圖1b)。這些結(jié)果表明，雖然H7N9病毒的毒力小于H5N1和H1N1病毒株，但該病毒能通過(guò)高劑量感染小鼠并至其死亡。

當(dāng)小鼠感染H7N9病毒后(感染劑量為106TCID50)，感染后2 d體重減輕，感染后7 d平均體重下降達(dá)到22%(彩插11圖1c)。此外，感染后3 d觀(guān)察到豎毛癥狀，感染后4 d的發(fā)病率達(dá)到了100%(彩插11圖1d&e)。14 d后感染的臨床癥狀逐漸恢復(fù)。

2.2 H7N9感染后在小鼠體內(nèi)分布

感染后1～7 d，均能從三種病毒感染小鼠肺部分離出活病毒(表1)。從感染小鼠的肝臟，腎臟，小腸還能瞬時(shí)性地分離得到H5N1或H7N9，但未能分離出H1N1(表1)。

表1 3種病毒感染小鼠和同居感染小鼠組織中病毒效價(jià)的測(cè)定(n=6)

與H5N1感染小鼠相似，小鼠感染H7N9，2 d后能從腦組織中分離出活病毒，表明H7N9可以在感染小鼠的腦組織中復(fù)制，在小鼠體內(nèi)也具有高致病性。

RT-PCR結(jié)果顯示，病毒主要在肺和鼻腔中復(fù)制，并在感染后第3天達(dá)到最大值(彩插11圖1f)。H7N9感染后與H5N1型病毒感染的IHC結(jié)果相似，病毒主要分布在肺支氣管和肺泡的上皮細(xì)胞，腸上皮細(xì)胞，腎的腎小管以及大腦的脈絡(luò)叢中。在腦實(shí)質(zhì)中也檢出了H5N1的抗原(數(shù)據(jù)未示出)。而H1N1感染的小鼠主要只在肺組織的中檢出(彩插11圖1g)。

感染小鼠肺部在感染后表現(xiàn)出嚴(yán)重的病理變化。感染后1 d出現(xiàn)肺間質(zhì)性肺血管的擴(kuò)張。感染后3 d和感染后5 d分別在腸道和腎臟觀(guān)察到：融合性的間質(zhì)性肺炎，支氣管和肺泡上皮細(xì)胞壞死，充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維蛋白滲出(彩插11圖1h)。

2.3 H7N9在小鼠間接觸傳播模型

將7只健康小鼠與3只感染24 h后小鼠(106TCID50經(jīng)鼻感染)同籠飼養(yǎng),進(jìn)行直接接觸。在H7N9直接接觸小鼠的肺和腸道檢測(cè)到病毒；然而，在H5N1直接接觸小鼠組織內(nèi)，未能檢測(cè)到病毒(表1，彩插12圖2a)。所有H7N9直接接觸小鼠在4 d后表現(xiàn)出顯著的體重減輕和豎毛現(xiàn)象(彩插12圖2c-d)，第5天，小鼠的發(fā)病率達(dá)到92%，隨后，體重及臨床癥狀分別在第7天和第14天恢復(fù)正常。與感染小鼠類(lèi)似，在直接接觸小鼠體內(nèi)，病毒抗原主要分布在肺、腸、腎組織中(彩插12圖2e)。前3d未在接觸感染小鼠體內(nèi)觀(guān)察到明顯組織病變，而在感染后第5天和第7天分別觀(guān)察到間質(zhì)肺血管擴(kuò)張和充血(彩插12圖2f)。

3 討論

結(jié)果表明從病人身上分離的新型H7N9病毒可以有效地感染小鼠并引起病變。A/Anhui/1/2013基因組的遺傳分析確定，該病毒中E627基因替代了其它禽流感病毒的PB2基因[1]。有研究表明，這種突變與禽流感病毒在哺乳動(dòng)物中復(fù)制能力的增強(qiáng)相關(guān)，它在提高H7N9對(duì)哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性中起到重要作用。

H7N9病毒能在小鼠間傳播，這與最近進(jìn)行的H7N9(SH2株)感染雪貂的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合[17]。以前的研究已經(jīng)表明，HA基因氨基酸突變對(duì)于病毒在哺乳動(dòng)物中的傳播起重要作用[18]，并且HA中Q226L的置換增強(qiáng)了病毒與人類(lèi)受體相結(jié)合的能力[19-20]，并可能改變結(jié)合禽類(lèi)受體到優(yōu)先結(jié)合人類(lèi)的結(jié)合傾向性[21]。

A/Shanghai/1/2013是首個(gè)從患者體內(nèi)分離的新型禽流感H7N9病毒，比A/Anhui/1/2013提前一個(gè)月。研究人員從A/Anhui/1/2013病毒株中發(fā)現(xiàn)，HA基因中的210-loop區(qū)存在Q226L(H3編序)置換，但未發(fā)現(xiàn)在A(yíng)/Shanghai/1/2013病毒株中存在該置換[1-2]。我們的研究表明，A/Anhui/1/2013與H1N1病毒傳染相類(lèi)似，可在小鼠間通過(guò)直接接觸傳播。因此我們建議，對(duì)H7N9突變后的流行可能性進(jìn)行監(jiān)控及深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Gao R；Cao B； Hu Y, et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus[J]. In N Engl J Med, 2013，368(20):1888-1897.

[2] Kageyama T；Fujisaki S；Takashita E, et al.. Genetic analysis of novel avian A(H7N9) influenza viruses isolated from patients in China, February to April 2013[J]. Euro Surveill，2013，18(15):20453.

[3] Chen Y；Liang W；Yang S, et al. Human infections with the emerging avian influenza A H7N9 virus from wet market poultry: clinical analysis and characterisation of viral genome[J]. Lancet，2013，381(9881):1916-1925.

[4] Blisard KS；Davis LE.The sequence of changes in liver and brain in the influenza B virus mouse model of Reye’s syndrome[J]. J Neuropathol Exp Neurol，1990，49(5):498-508.

[5] Dong W；Li-Feng X；Cun-Lian W, et al. A mouse model of swine influenza virus H9N2 infection with acute lung injury[J]. Acta Virol，2012，56(3):227-33.

[6] Jurgens HA；Amancherla K；Johnson RW. Influenza infection induces neuroinflammation, alters hippocampal neuron morphology, and impairs cognition in adult mice[J]. J Neurosci，2012， 32(12):3958-3968.

[7] Ko?er ZA；Krauss S；Stallknecht DE, et al. The potential of avian H1N1 influenza A viruses to replicate and cause disease in mammalian models[J]. PLoS One，2012，7(7):e41609

[8] Tait AR；Davidson BA；Johnson KJ, et al. Halothane inhibits the intraalveolar recruitment of neutrophils, lymphocytes, and macrophages in response to influenza virus infection in mice[J]. Anesth Analg，1993，76(5):1106-1113.

[9] Xu L； Bao L；Li F, et al. Adaption of seasonal H1N1 influenza virus in mice[J]. PLoS One， 2011，6(12):e28901.

[10] Abashidze T； Gogiashvili L；Tsagareli Z. The morphology and pathogenesis of lesions in mice brain cortex under influenza virus A (H3N1 1/62) infection[J]. Georgian Med News，2011，(195):95-100.

[11] Gubareva LV；McCullers JA；Bethell RC, et al.Characterization of influenza A/HongKong/156/97 (H5N1) virus in a mouse model and protective effect of zanamivir on H5N1 infection in mice[J]. J Infect Dis，1998，178(6):1592-1596.

[12] Shinya K；Suto A；Kawakami M, et al. Neurovirulence of H7N7 influenza A virus: brain stem encephalitis accompanied with aspiration pneumonia in mice[J]. Arch Virol，2005，150(8):1653-1660.

[13] Belser JA；Lu X；Maines TR, et al. Pathogenesis of avian influenza (H7) virus infection in mice and ferrets: enhanced virulence ofEurasian H7N7 viruses isolated from humans[J]. J Virol，2007， 81(20):11139-11147.

[14] Hodgson NR；Bohnet SG；Majde JA, et al. Influenza virus pathophysiology and brain invasion in mice with functional and dysfunctional Mx1 genes[J]. Brain Behav Immun，2012，26(1):83-9.

[15] Maines TR；Lu XH；Erb SM, et al. Avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans in Asia in 2004 exhibit increased virulence in mammals[J]. J Virol，2005，79(18):11788-11800.

[16] Reinacher M； Bonin J；Narayan O, et al. Pathogenesis of neurovirulent influenza A virus infection in mice. Route of entry of virus into brain determines infection of different populations of cells[J]. Lab Invest，1983，49(6):686-692.

[17] Zhu H；Wang D； Kelvin DJ，et al. Infectivity, Transmission, and Pathology of Human-Isolated H7N9 Influenza Virus in Ferrets and Pigs[J]. Science. 2013，12;341(6142):183-186.

[18] Gao Y；Zhang Y；Shinya K，et al. Identification of amino acids in HA and PB2 critical for the transmission of H5N1 avian influenza viruses in a mammalian host[J]. PLoS Pathog，2009，5(12):e1000709.

[19] Herfst S；Schrauwen EJ；Linster M,et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets[J]. Science 2012，22;336(6088):1534-1541.

[20] Imai M；Watanabe T；Hatta M,et al. Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HA/H1N1 virus in ferrets[J]. Nature，2012，2;486(7403):420-428.

[21] Rogers GN；Daniels RS；Skehel JJ, et al. Host-mediated selection of influenza virus receptor variants. Sialic acid-alpha 2,6Gal-specific clones of A/duck/Ukraine/1/63 revert to sialic acid-alpha 2,3Gal-specific wild type in ovo[J]. J Biol Chem，1985，25;260(12):7362-7367.