新型禽源人流感病毒(H7N9)的小鼠感染模型和傳播模型建立

陳 霆，鮑琳琳，朱 華，鄧 巍，許黎黎，呂 琦，李楓棣，秦 川

(中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

首次人感染禽源甲型流感病毒(H7N9株)報道發(fā)表于2013年3月[1]。該新型病毒的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(N)基因可能起源于歐亞禽流感病毒，而其余的基因與H9N2型禽流感病毒密切相關(guān)[2]。這一重組流感病毒會對人類造成嚴重甚至致死性的呼吸系統(tǒng)疾病。報告顯示，138個感染者中37人死亡。大多數(shù)患者有活禽接觸史，提示該病毒可以通過家禽對人跨物種進行傳播[3]。在2003年荷蘭爆發(fā)的H7N7疫情中發(fā)現(xiàn)，病毒的人際傳播十分有限。然而，曾被報道的三宗疑似家庭病例群集也應引起人們的重視，這表明對于H7N9病毒在哺乳動物中的感染性、毒力研究以及傳播力的研究十分重要。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株：病毒株為H7N9 (strain A/Anhui/1/2013)，由中國疾病預防控制中心流感中心贈予。該病毒株序列與全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織(GISAID)的流感序列數(shù)據(jù)庫中No.EPI439503和No.EPI439510的序列一致。

1.1.2 動物：雌性5周齡無特定病原體BALB/c小鼠，由來自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證號：SCXK(京)2012-0001)。所有操作經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學實驗動物研究所動物管理委員會批準，所有的感染實驗均在ABSL-3實驗室中進行，批號ILAS-PC-2013-007。

1.2 方法

1.2.1 LD50測定

通過鼻內(nèi)感染小鼠測定H7N9(A/Anhui/1/2013)的半數(shù)致死量(LD50)。H5N1病毒(A/SZ/406H/06)和H1N1病毒(A/CA/07/09)作為對照。

1.2.2 小鼠感染實驗

每只接種106TCID50病毒感染小鼠，通過MDCK細胞進行測定。

1.2.3 小鼠直接接觸感染實驗

采用直接接觸小鼠模型來探索新型H7N9病毒的傳播能力。將7只健康小鼠與3只感染24后小鼠(106TCID50經(jīng)鼻感染)同籠飼養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 H7N9病毒在小鼠體內(nèi)毒力檢測

三種病毒的LD50分別為107.5 TCID 50(H7N9)、101TCID50(H5N1)及104.8TCID50(H1N1)(彩插11圖1a)。

當接種劑量為106TCID 50時，感染H5N1或H1N1病毒的小鼠在觀察期內(nèi)死亡，但感染H7N9病毒的小鼠未觀察到死亡(彩插11圖1b)。這些結(jié)果表明，雖然H7N9病毒的毒力小于H5N1和H1N1病毒株，但該病毒能通過高劑量感染小鼠并至其死亡。

當小鼠感染H7N9病毒后(感染劑量為106TCID50)，感染后2 d體重減輕，感染后7 d平均體重下降達到22%(彩插11圖1c)。此外，感染后3 d觀察到豎毛癥狀，感染后4 d的發(fā)病率達到了100%(彩插11圖1d&e)。14 d后感染的臨床癥狀逐漸恢復。

2.2 H7N9感染后在小鼠體內(nèi)分布

感染后1～7 d，均能從三種病毒感染小鼠肺部分離出活病毒(表1)。從感染小鼠的肝臟，腎臟，小腸還能瞬時性地分離得到H5N1或H7N9，但未能分離出H1N1(表1)。

表1 3種病毒感染小鼠和同居感染小鼠組織中病毒效價的測定(n=6)

與H5N1感染小鼠相似，小鼠感染H7N9，2 d后能從腦組織中分離出活病毒，表明H7N9可以在感染小鼠的腦組織中復制，在小鼠體內(nèi)也具有高致病性。

RT-PCR結(jié)果顯示，病毒主要在肺和鼻腔中復制，并在感染后第3天達到最大值(彩插11圖1f)。H7N9感染后與H5N1型病毒感染的IHC結(jié)果相似，病毒主要分布在肺支氣管和肺泡的上皮細胞，腸上皮細胞，腎的腎小管以及大腦的脈絡叢中。在腦實質(zhì)中也檢出了H5N1的抗原(數(shù)據(jù)未示出)。而H1N1感染的小鼠主要只在肺組織的中檢出(彩插11圖1g)。

感染小鼠肺部在感染后表現(xiàn)出嚴重的病理變化。感染后1 d出現(xiàn)肺間質(zhì)性肺血管的擴張。感染后3 d和感染后5 d分別在腸道和腎臟觀察到：融合性的間質(zhì)性肺炎，支氣管和肺泡上皮細胞壞死，充血，炎性細胞浸潤及纖維蛋白滲出(彩插11圖1h)。

2.3 H7N9在小鼠間接觸傳播模型

將7只健康小鼠與3只感染24 h后小鼠(106TCID50經(jīng)鼻感染)同籠飼養(yǎng),進行直接接觸。在H7N9直接接觸小鼠的肺和腸道檢測到病毒；然而，在H5N1直接接觸小鼠組織內(nèi)，未能檢測到病毒(表1，彩插12圖2a)。所有H7N9直接接觸小鼠在4 d后表現(xiàn)出顯著的體重減輕和豎毛現(xiàn)象(彩插12圖2c-d)，第5天，小鼠的發(fā)病率達到92%，隨后，體重及臨床癥狀分別在第7天和第14天恢復正常。與感染小鼠類似，在直接接觸小鼠體內(nèi)，病毒抗原主要分布在肺、腸、腎組織中(彩插12圖2e)。前3d未在接觸感染小鼠體內(nèi)觀察到明顯組織病變，而在感染后第5天和第7天分別觀察到間質(zhì)肺血管擴張和充血(彩插12圖2f)。

3 討論

結(jié)果表明從病人身上分離的新型H7N9病毒可以有效地感染小鼠并引起病變。A/Anhui/1/2013基因組的遺傳分析確定，該病毒中E627基因替代了其它禽流感病毒的PB2基因[1]。有研究表明，這種突變與禽流感病毒在哺乳動物中復制能力的增強相關(guān)，它在提高H7N9對哺乳動物的適應性中起到重要作用。

H7N9病毒能在小鼠間傳播，這與最近進行的H7N9(SH2株)感染雪貂的實驗結(jié)果相吻合[17]。以前的研究已經(jīng)表明，HA基因氨基酸突變對于病毒在哺乳動物中的傳播起重要作用[18]，并且HA中Q226L的置換增強了病毒與人類受體相結(jié)合的能力[19-20]，并可能改變結(jié)合禽類受體到優(yōu)先結(jié)合人類的結(jié)合傾向性[21]。

A/Shanghai/1/2013是首個從患者體內(nèi)分離的新型禽流感H7N9病毒，比A/Anhui/1/2013提前一個月。研究人員從A/Anhui/1/2013病毒株中發(fā)現(xiàn)，HA基因中的210-loop區(qū)存在Q226L(H3編序)置換，但未發(fā)現(xiàn)在A/Shanghai/1/2013病毒株中存在該置換[1-2]。我們的研究表明，A/Anhui/1/2013與H1N1病毒傳染相類似，可在小鼠間通過直接接觸傳播。因此我們建議，對H7N9突變后的流行可能性進行監(jiān)控及深入研究。

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