雪貂感染H7N9禽流感病毒動物模型的建立

鄧 巍，許黎黎，鮑琳琳，朱 華，陳 霆，呂 琦，李楓棣，袁 靜，向志光，高 凱，徐艷峰，黃 瀾，李彥紅，劉江寧，姚艷豐，于 品，秦 川

(中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

2013年3月在中國東部地區爆發了H7N9禽流感疫情，患者的主要表現為進行性重度肺炎和呼吸困難[1]。截止至8月6日，全國10省市發生人感染H7N9禽流感病例132例，其中死亡43人。因此在疫情不斷發展的情況下，迅速建立該疾病的實驗動物模型，為H7N9禽流感發病機制研究、疫苗及藥物的評價提供實驗基礎是必要而迫切的。自1933年以來雪貂因其對人和禽流感病毒易感，就一直被用作流感模式動物[2]。 感染流感病毒后，雪貂的呼吸道癥狀以及肺部病變與人類十分相似[3]。本實驗利用雪貂(Mustela putorius furo) 成功建立了H7N9感染的實驗動物疾病模型。

1 材料與方法

1.1 病毒

流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9) 來自于第3例確診的H7N9患者，接種9～11 d SPF 雞胚，然后在MDCK細胞上傳代一次。

1.2 細胞

MDCK細胞購自ATCC，無支原體污染，細胞用MEM培養基培養(MEM, Invitrogen)，培養基內加入10%的胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素，培養條件為 37℃，5% CO2。

1.3 動物感染及標本采集

9只SPF級雪貂購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，6～12月齡，所有動物血清對流行的流感病毒的血凝抑制(HI)試驗檢測結果均為陰性。雪貂分2組，第一組3只，每只動物滴鼻感染400 μL 108TCID50的A/Anhui/1/2013 (H7N9)病毒，每天進行CT肺部掃描查；第二組6只動物，每只動物滴鼻感染400 μL 106TCID50的A/Anhui/1/2013 (H7N9)病毒，在感染后的第3、第7天分別隨機安樂死1只動物，對其氣管、肺、腦、心臟、肝臟、脾、腎、胃、十二指腸以及嗅球進行病理及病毒學檢測。所有9只雪貂每天記錄臨床癥狀及體重，分別在感染后第1，3，5，7，9天采集感染雪貂的鼻拭子和咽拭子，保存于1 mL PBS中，并接種于MDCK細胞，測定病毒滴度。

本實驗由北京協和醫學院醫學實驗動物研究所動物使用和倫理委員會批準(ILAS-PC-2013-009)。所有的實驗都按照WHO指導原則在ABSL-3實驗室內進行(許可證號：ABSL3-021，CANS BL0010)。

1.4 病毒滴度

本實驗采用MDCK細胞測定病毒的滴度。10倍系列稀釋的各組織勻漿、鼻拭子、咽拭子接種于單層MDCK細胞中，37℃ 孵育1 h后，用PBS洗一次，并加入200 μL病毒培養基(MEM培養基中加入100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和1 μg/mL 胰蛋白酶)，接種后第3天，收集被感染細胞上清，用火雞血測定凝血活性，以此判定細胞是否被感染。利用Reed-Muench 計算組織細胞半數感染量(TCID50)[4]。

1.5 組織病理和免疫組化

根據標準操作規程進行動物尸檢，組織置于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋，4 μm 連續切片，蘇木精-伊紅(H&E)染色，光學顯微鏡檢查。免疫組化使用抗甲型流感病毒核蛋白的單克隆抗體(1∶200稀釋, IRR 公司, 貨號: FR-51) 4℃過夜，PBS洗滌3次，加入HRP標記的羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀釋，Sigma公司，貨號：PV-9002)，加入3-3-二氨基聯苯胺 (DAB)，光學顯微鏡觀察。

1.6 血細胞分析

采集每只動物外周血保存于肝素抗凝管內，利用ACT TM(貝克曼公司，美國)血常規儀對血樣本進行血細胞計數分析。

1.7 Micro-CT掃描

使用Micro-CT掃描儀(西門子醫療公司，德國)觀察雪貂肺部情況，感染雪貂麻醉后平躺在CT床上，保持呼吸通暢。管電壓為70 kV，電流為400 mA，曝光時間為800 ms，掃描范圍(FOV)為72.44 mm×71.31mm。通過單球管/探測器CT系統以步進1度旋轉360度以獲得圖像投影。使用市售的濾波反投影技術成像軟件(COBRA Exxim, v6.3) 進行圖像重建。

1.8 血凝抑制試驗(HI)

使用0.5%的火雞血進行雪貂血清的血凝抑制試驗實驗。采集雪貂外周血，分離血清，按照WHO頒布的標準HI測定方法測定收集的血清對H7N9病毒的血凝抑制價[5]。

1.9 統計分析

雪貂的體重、病毒拷貝數以及病毒滴度在不同組之間存在的差異進行ANOVA單因素方差分析和Bonferroni校正分析。兩組之間的差異運用SPSS 11.5 軟件包中的t-test進行分析。P<0.05時，兩者之間存在顯著性差異。

2 結果

2.1 癥狀和體征

兩個感染劑量組的雪貂均表現出發熱，體重下降，打噴嚏，流鼻涕，嗜睡(封底圖1A和1B，表1)，食欲下降。在感染后14 d的觀察期內，108劑量組的雪貂體溫最高可達到40.0℃(感染后第2天)體重降低程度最高可達10.7%(感染后第7天)，106劑量組的雪貂則分別為40.1℃(感染后第4天)和9.3%(感染后第5天)(圖2A和2B)。

此外，108劑量組的3只雪貂CT掃描結果顯示，感染后第6～14天，在肺的左上葉、右上葉以及右中葉可見片狀炎癥陰影(封底圖1C)。

2.2 血液學變化

臨床報道感染H7N9病毒的患者白細胞數量下降[1,6-7]。在感染后第7天雪貂外周血檢測發現雪貂淋巴細胞明顯減少，而中性粒細胞增加明顯(P<0.05) (表2)。

2.3 動物排毒情況

感染后第1，3，5，7，9天采集感染雪貂的鼻拭子和咽拭子，接種MDCK細胞進行病毒滴度的測定。感染后第1天兩個劑量感染雪貂均開始排毒，一直持續到感染后第7天。兩個劑量上呼吸道排毒的峰值分別出現在感染后第3天的咽拭子(108劑量組)，滴度到達104.38TCID50/mL，以及感染后第5天的鼻拭子(106劑量組)，滴度為104.11TCID50/mL(圖2C)。

2.4 解剖及病理學變化

感染后第3和第7天隨機安樂死一只感染106TCID50H7N9禽流感病毒的雪貂，對其氣管、肺、腦、心臟、肝臟、脾、腎、胃、十二指腸以及嗅球進行病理及病毒學檢測。組織病理學分析顯示雪貂肺組織于感染后第3天出現多病灶的輕度間質性肺炎，感染后第7天肺組織可見局灶性間質性肺炎及肺泡炎樣改變，病灶出現增大、熔合的現象(封底圖3C和3D)。另外，免疫組化結果顯示H7N9禽流感病毒可同時感染雪貂支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞 (封底圖3A和3B)。

注：圖A、B、C分別為雪貂感染后平均體溫、平均體重、及上呼吸道排毒平均水平。

表1 雪貂感染H7N9禽流感病毒后的臨床癥狀以及各組織病毒復制情況

表2 雪貂感染H7N9禽流感病毒后的血像變化情況

2.5 病毒在體內分布情況

將感染后第3、7天的雪貂各組織勻漿，接種MDCK細胞，測定病毒滴度。結果顯示在感染后第3天肺、氣管、心臟、嗅球可檢測到活病毒，而在感染后第7天肺、氣管、肝臟可檢測到活病毒(表1)。H7N9禽流感病毒可在神經系統(嗅球)復制的特性與高致病性禽流感H5N1，H7N7相似[8-10]。

3 討論

綜上，H7N9禽流感病毒可感染雪貂，引起動物出現典型的打噴嚏、發熱等臨床癥狀和體征，可檢測到上呼吸道排毒及肺、氣管、嗅球等組織內的病毒復制情況，組織病理學變化可見肺組織炎性改變。雪貂感染H7N9禽流感病毒后的變化與人感染后的變化是相似程度較高[11-13]，說明雪貂可作為H7N9感染模型動物之一。雪貂感染H7N9模型動物的建立可為H7N9致病機制研究、治療藥物和疫苗的評價提供科學的動物模型基礎。

參考文獻：

[1] Gao R, Cao B, Hu Y, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus [J]. N Engl J Med. 2013, 368(20):1888-1897.

[2] Smith W, Andrewes CH, Laidlaw PP. A virus obtained from influenza patients [J]. Lancet 1933, 222:66.

[3] Maher JA, DeStefano J. The ferret: an animal model to study influenza virus [J]. Lab Anim (NY) 2004, 33(9):50-53.

[4] Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints [J]. The American Journal of Hygiene 1938, 27(3):493-497.

[5] World Health Organization Gisn. Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza [M]. Geneva, Switzerland: World Health Organization. 2011:140.

[6] Chang SY, Lin PH, Tsai JC, et al. The first case of H7N9 influenza in Taiwan [J]. Lancet 2013, 381(9878):1621.

[7] Chen Y, Liang W, Yang S, et al. Human infections with the emerging avian influenza A H7N9 virus from wet market poultry: clinical analysis and characterisation of viral genome [J]. Lancet 2013, 381(9881):1916-1925.

[8] Blisard KS, Davis LE. The sequence of changes in liver and brain in the influenza B virus mouse model of Reye’s syndrome [J]. J Neuropathol Exp Neurol. 1990, 49(5):498-508.

[9] Hodgson NR, Bohnet SG, Majde JA, et al. Influenza virus pathophysiology and brain invasion in mice with functional and dysfunctional Mx1 genes [J]. Brain Behav Immun. 2011, 26(1):83-89.

[10] Shinya K, Suto A, Kawakami M, et al. Neurovirulence of H7N7 influenza A virus: brain stem encephalitis accompanied with aspiration pneumonia in mice [J]. Arch Virol. 2005, 150(8):1653-1660.

[11] Belser JA, Gustin KM, Pearce MB, et al. Pathogenesis and transmission of avian influenza A (H7N9) virus in ferrets and mice [J]. Nature. 2013, 501(7468): 556-559.

[12] Watanabe T, Kiso M, Fukuyama S, et al. Characterization of H7N9 influenza A viruses isolated from humans [J]. Nature. 2013, 501(7468): 551-555.

[13] Zhu H, Wang D, Kelvin DJ, et al. Infectivity, transmission, and pathology of human H7N9 influenza in ferrets and pigs. Science 2013, 341(6142):183-186.