嗜堿性粒細胞在膠原誘導性關節(jié)炎模型小鼠Th1/Th2應答失衡中的作用

陳秋華，唐 培，謝 彤，吳 平，蘭巧芬，XIAO Hai-yan ，潘慶軍

(1.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣東，湛江 524001；2. Georgia Regents University, Cancer Center, Augusta, GA 30912, USA)

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以慢性關節(jié)炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)和預后呈高度異質(zhì)性，易反復發(fā)作，致殘率較高，目前尚無較好的根治方法。RA發(fā)病機制雖尚未完全解析，但輔助性T細胞(Thl/Th2)應答失衡在RA發(fā)病中的重要作用已被廣泛認知[1]。然而，導致RA患者Th1/Th2失衡的原因及機制尚不清楚，因此，深入研究RA發(fā)病中Th1/Th2失衡的原因及機制將有助于RA的防治。

嗜堿性粒細胞參與過敏反應已被熟知[2]，近年有關嗜堿性粒細胞在天然免疫、獲得性免疫、免疫平衡調(diào)節(jié)等方面的研究取得了長足的進展和令人矚目的成就。在免疫調(diào)節(jié)方面，嗜堿性粒細胞表面表達高水平的IgE受體FcεRI，通過與抗原特異IgE交聯(lián)，或其他的活化途徑，能產(chǎn)生Th2型細胞因子如IL-4和IL-13，介導Th0向Th2細胞分化[3，4]，而Th2型增強體液免疫應答。因此，嗜堿性粒細胞可通過增強Th2應答和削弱Th1應答而影響Th1/Th2平衡，進而參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程，但至今，在RA方面研究極少。

膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis, CIA)是最常用的類風濕性關節(jié)炎動物模型。由于其重復性好、易于界定、并被證實對類風濕性關節(jié)炎新療法的發(fā)展有用而被廣泛接受。

基于此，本文采用經(jīng)典的膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型，探討嗜堿性粒細胞在膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型Th1/Th2失衡中的作用。有望為RA的發(fā)病機制和臨床防治提供線索。

1 材料和方法

1. 1 動物和實驗材料

SPF級5～6周C57/BL6雄性小鼠，體重(15～18)g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心(粵監(jiān)證字2008A055，合格證號0045725)， 飼養(yǎng)在廣東醫(yī)學院實驗動物中心[SYXK(粵) 2010-0063]，25℃ 12 h 晝夜節(jié)律、55%濕度的飼養(yǎng)箱環(huán)境，喂養(yǎng)商品飼料和滅菌自來水。

牛II型膠原(Type II collagen)和弗氏完全和不完全佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司。小鼠IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒購自武漢博士德公司。紅細胞裂解液、染色液、固定通透液、抗小鼠CD49B-FITC、IgE-PE抗體和APC-IL-4抗體購自美國Biolegend公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1. 2 方法

1. 2. 1 膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型的建立：依照參考文獻[5]，將牛II型膠原(Type II collagen)溶解于0.05 mol/L冰醋酸中，濃度為2 g/L，將溶解的膠原與弗氏完全佐劑等體積混合，在冰浴中使用勻漿器充分乳化。模型組小鼠6只，對照組6只。免疫時，在小鼠背部和尾根部多點皮內(nèi)注射0.1 mL乳劑(含100 mg 膠原和200 mg結核分支桿菌)。首次免疫后3周行第二次免疫，方法同第一次(佐劑換為弗氏不完全佐劑)，避開初次免疫部位，進行加強免疫。同時，對照組用CFA與0.05 mol/L冰醋酸等體積充分乳化后按上述方法進行免疫及21天加強免疫，制備膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型。

1.2.2 小鼠外周血和淋巴結組織采集和檢測：分別在建模(初次免疫)前、建模后1周、3、6和9周眶靜脈采血，肝素抗凝，并進行指標檢測。同時進行關節(jié)腫脹的評分。

淋巴結細胞的制備參考[6]將C57/BL6小鼠斷髓處死，無菌分離雙側(cè)頜下、腋窩、鎖骨下、腹股溝淺表和腸系膜淋巴結，去掉被膜，于200目尼龍網(wǎng)篩研磨過濾，于4℃下200 r/min離心8 min收集細胞，4℃下PBS(0.05 mol/L, pH 7.2)洗滌2次，重懸后流式檢測。

1. 2. 3 ELISA檢測血清IFN-γ和IL-4：分別在建模(初次免疫)前、建模后1周、建模后8周眶靜脈采血，300 r/min離心15 min，收集上清液，-20℃凍存，檢測備用。用ELISA方法檢測血清IL-4和IFN-γ水平。

1. 2. 4 流式細胞術檢測外周嗜堿性粒細胞：分別在建模(初次免疫)前、建模后1周、建模后8周眶靜脈采血，利用流式細胞術對外周血和淋巴結組織中嗜堿性粒細胞數(shù)量和表達IL-4的比例檢測。具體為：取200 μL抗凝血，分別加入抗小鼠CD49B-FITC和IgE-PE抗體，室溫孵育30 min，加入紅細胞裂解液，室溫避光15 min，300 r/min離心5 min，再用染色液重懸洗滌一次，再加入固定和透膜液10 min，離心去除固定和透膜液，染色液重懸后加入抗小鼠APC-IL-4抗體進行胞內(nèi)染色15 min，加入染色液離心洗滌2次，最后將標記的細胞重懸200 μL染色液上流式檢測，CD49b和IgE雙陽性為嗜堿性粒細胞，再計算IL-4陽性的嗜堿性粒細胞占總嗜堿性粒細胞的比例。

1. 3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)都采用SPSS 13.0分析，用均數(shù)±標準差表達。對照組和模型組檢測指標比較使用兩獨立樣本t檢驗(Independent Student’st-test)，P<0. 05認為差異有顯著性。

2 結果

2. 1 膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型的建立

初次免疫后3周(既第21天)左右小鼠關節(jié)開始出現(xiàn)腫脹，起初為兩后足紅腫，逐漸延伸到前足和尾部，第42天左右腫脹達到最高，而后逐漸減輕。小鼠毛色、精神狀態(tài)和糞便等在21 d前無顯著變化，21 d后CIA組小鼠開始出現(xiàn)被毛松弛，行動遲緩，關節(jié)腫脹明顯，少數(shù)小鼠可見局部足爪輕度潰瘍(圖1)。小鼠關節(jié)腫脹的評分見表1。

圖1 對照組和CIA模型組小鼠后足初次免疫后第42天腫脹情況

2. 2 血清IFN-γ和IL-4的比值

CIA模型小鼠誘導早期，既初次免疫后1周和3周，血清IFN-γ/IL-4水平的比值顯著低于對照組(圖2)，提示Th2應答失衡。而CIA模型小鼠誘導中晚期，既初次免疫后6周和9周，血清IFN-γ/IL-4的比值顯著高于對照組(圖2)，提示以Th1應答為主。

圖2 CIA模型組和對照組小鼠血清IFN-γ/IL-4水平的比值的變化情況(*，P <0.05；**，P <0.01)

2. 3 流式細胞術檢測外周嗜堿性粒細胞數(shù)量和活化情況

CIA模型小鼠誘導早期，既初次免疫后1周和3周，外周嗜堿性粒細胞數(shù)量顯著高于對照組(圖3A)。而CIA模型小鼠誘導中晚期，既初次免疫后6周和9周，外周嗜堿性粒細胞IL-4陽性的百分比顯著高于對照組(圖3B)。

2. 4 流式細胞術檢測淋巴結組織中嗜堿性粒細胞

CIA模型小鼠誘導早期，既初次免疫后1、3、6和9周，淋巴結組織中可檢測到嗜堿性粒細胞，對照組小鼠則無(圖4)。

表1 小鼠關節(jié)腫脹的評分

圖3 CIA模型組和對照組小鼠外周血嗜堿性粒細胞數(shù)量和活化變化情況(*，P <0.05；**，P <0.01)

圖4 流式檢測CIA模型組和對照組小鼠淋巴結組織中嗜堿性粒細胞

3 討論

RA患者Thl/Th2應答失衡模式的研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2型細胞因子的產(chǎn)生在RA疾病的早期和晚期不同，提示在不同發(fā)病期可能存在Thl/Th2應答失衡模式的改變。在RA發(fā)病早期外周血單個核細胞中以Th2應答為主，而長期慢性RA則以Th1應答為主[1]。而且，在RA出現(xiàn)臨床關節(jié)病變的最早期，在滑膜和滑膜液中呈現(xiàn)短暫的以Th2為主的細胞因子譜(IL-4和IL-13等)，而顯著缺乏Th1型細胞因子(IFN-γ等)，這可決定早期滑膜炎發(fā)展成RA而不是非類風濕持久性滑膜炎[7]。在1例成年RA患者活動期滑膜中首先發(fā)現(xiàn)以Th2應答為主，而外周單個核細胞中以Th1應答為主，而后滑膜中發(fā)展為以Th0和Th1應答為主，且與RA炎癥相關[8]。提示，在RA患者外周血和關節(jié)滑膜液中Th1/Th2應答失衡的模式，在不同病期可能會發(fā)生轉(zhuǎn)換。

嗜堿性粒細胞通過IgE高親和力受體FcεRl與IgE-抗原復合物交聯(lián)，可誘導嗜堿性粒細胞活化進而釋放炎性介質(zhì)而介導組織損傷。RA患者高滴度的IgE抗體主要以免疫復合物形式存在[9]，在外周血和關節(jié)液中可檢測到包含IgE抗體的循環(huán)免疫復合物(IgE-CIC)[10-12]，且IgE-CIC陽性的RA患者疾病活動度高于陰性的RA患者[13]，IgE-CIC可活化炎癥效應細胞，如肥大細胞、中性粒細胞和單核細胞等[14,15]，促進RA疾病進展。瓜氨酸化蛋白和IgE型抗瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)形成的免疫復合物可通過FcεRI受體交聯(lián)活化RA患者嗜堿性粒細胞[16]。提示在RA中IgE型免疫復合物可能介導嗜堿性粒細胞活化，其介導的嗜堿性粒細胞的活化在RA發(fā)病中的作用有待進一步研究。

另外，本模型選用的是C57/BL6小鼠，在天然免疫中以Th1應答為主，而BALB/c則以Th2應答為主[17]，基于本項目中Th1/Th2應答與CIA模型誘導密切相關，而嗜堿性粒細胞是影響Th1/Th2應答，特別是Th2應答的關鍵細胞，故研究嗜堿性粒細胞在膠原誘導性關節(jié)炎模型小鼠Th1/Th2應答失衡中的作用時，要考慮C57/BL6小鼠和BALB/c不同背景的可能影響。

臨床上關于RA患者嗜堿性細胞的研究報道比較少，一個以800例RA患者為主的研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血嗜堿性粒細胞數(shù)量顯著減少，且處于活化狀態(tài)(以脫顆粒為活化標志)[18]。而另外一個以16例兒童RA患者為主的報道發(fā)現(xiàn)，幼年RA患者(juvenile rheumatoid arthritis, JRA)外周血嗜堿性粒細胞數(shù)量以增多為主(11/16)[19]。但目前，幼年類風濕性關節(jié)炎(JRA)現(xiàn)已更名為幼年特發(fā)性關節(jié)炎(juvenile idiopathic arthritis, JIA)研究例數(shù)較少。另外根據(jù)臨床經(jīng)驗，我們推測，可能與JRA患兒確診時大部分處于發(fā)病的早期，而成年RA患者確診時大部分處于發(fā)病的中晚期相關，有待進一步研究。

綜上，嗜堿性粒細胞可能在CIA模型小鼠Th1/Th2應答失衡中發(fā)揮了作用，進而參與其發(fā)病過程。但CIA模型小鼠嗜堿性粒細胞活化和外周減少的機制，以及調(diào)控嗜堿性粒細胞數(shù)量和活化對CIA模型小鼠疾病進展的影響有待進一步深入研究，該研究有望為闡明RA發(fā)病機制和針對RA發(fā)病中Th1/Th2失衡的干預治療提供新的線索。

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