雌激素對小鼠心室肌細胞ATP敏感性鉀離子通道活性的影響

樸伶華，姜圣男，柳賢德

(1. 海南大學農學院，海口，海南 570228；2. 海南醫學院基礎醫學部，海口，海南 571199；3. 海南省海口市人民醫院，海口，海南 570109)

隨著生活水平的提高，心臟疾病的發生率也顯著增高。心臟疾病無論是發生率還是預后，絕經前女性要比同年齡男性低。女性在絕經后由于體內雌激素水平的下降，其發生率較前有明顯上升趨勢。雌激素可通過心肌細胞上的雌激素受體產生抑制心肌重塑、心肌肥大及減輕心肌缺血再灌注損傷等，起到對心臟的保護作用[1]。

心肌細胞膜含有一種內向整流式鉀通道，可以通過調節胞內ATP濃度水平而影響其活性的離子通道稱之為ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP通道)[2-4]。在心肌缺血發生后，心肌細胞膜可通過增強KATP通道活性，使得心肌動作電位時程縮短，從而可發生嚴重的折返性心律失常[5]。然而現今雌激素對KATP離子通道活性的影響還不是很清楚。因此本研究擬通過膜片鉗技術觀察雌激素對小鼠心肌細胞KATP通道活性的影響，進一步分析雌激素在心肌缺血中的保護作用。

1 材料和方法

1.1 小鼠單一心室肌細胞制備

ICR 小鼠(25～40)g，雄性，腹腔注射肝素1 000 U/Kg，15 min后頸椎脫臼，快速開胸取出心臟并置于4℃無鈣臺式液中洗掉部分血液，隨后迅速將心臟懸掛于Langendorff裝置上進行主動脈逆流灌流。先用無鈣臺式液灌流(5～10)min，之后換上0.5 g/L膠原酶II酶溶液灌流20 min，待組織變軟后換上KB溶液7 min，之后取下心室部分組織，置于KB溶液用吸管吹打，使細胞自然沉降，置于溶液中待用。灌流全程95% O2+ 5% CO2通氧。實驗在室溫(20～30)℃下進行。

1.2 實驗溶液與試劑

無鈣臺式液(mmoL): NaCl 137 g；KCl 5.4 g；MgCl21.0 g；HEPES 10 g；Glucose 10 g，用NaOH調節至pH 7.4。KB溶液：KCl 25 g；taurin 20 g；L-glutamic acid 70 g；MgCl23 g；HEPES 10 g；glucose 10 g；KH2PO410 g, EGTA 0.5 g，用KOH調節至pH 7.40。單離子通道記錄溶液(mmol)：KCl 140 g；MgCl22 g；EGTA 5 g；HEPES 10 g, 用HCl調節至pH 7.2。全細胞記錄溶液(mmol)：KCl 140 g；MgCl22 g； CaCl21 g；EGTA 11 g；HEPES 10 g，用KOH調節至pH 7.2。膜內向外記錄模式中，電極內溶液及浴液成分(mmol)：KCl 140 g，MgCl22 g， EGTA 5 及HEPES 10 g，用HCl調節至pH 7.2。

全細胞記錄模式中，浴液使用加入1 mol/L Ca2+的臺式液，電極內液體成分(mmol/L)：KCl 140 g，MgCl22 g, CaCl21 g, EGTA 11 g, 及HEPES 10 g，用KOH調節至pH 7.2。 Pinacidil 和2,4-dinitrophenol(DNP)作為KATP通道激動劑， glibenclamide作為通道活性抑制劑，使用PDBu(phorbol 12,13-dibutyrate)作為protein kinase C(PKC)激動劑，雌激素使用的是17α-ethynylestradiol 和 17β-estradiol。以上藥品均來自Sigma Chemical Co。

1.3 玻璃微電極制備

本實驗使用borosilicate玻璃管(Clark Electromedical Instruments Co., PG150T-7.5)在兩步拉制儀(Flaming/Brown Micropipette Puller, Sutter Instrument Co.,P-97)下制備電極電阻為4-5 MΩ的微電極。制備的微電極在光學顯微鏡(Stereozoom microscope, Nikon, SMZ-2B)下涂抹Sylgard(Coring Co.)直至電極末梢部位，并進行干燥處理。涂抹后的電極重新在光學顯微鏡(Microforge, Narishige,MF-83)下觀察(500倍)，并進行拋光處理后直至微電極電阻為2-7MΩ。

1.4 膜片鉗記錄與分析

選取橫紋及潤盤清楚的心肌細胞進行膜內向外及全細胞吸附膜片鉗方式記錄。用臺式液作為細胞外液進行灌注。將分離的心肌細胞置于倒置顯微鏡上的浴槽中，用膜片電極進行千兆封接。膜內向外及全細胞吸附形態形成后，信號由Ag/AgCl電極引導，經膜片鉗放大器為(Axopatch 200A, Axon Instruments Inc.)放大、數模轉換系統接收脈沖、采集數據，由pClamp7.0 (Axon Instruments Inc.)軟件程序記錄并分析信號。上述個實驗在37℃恒溫下進行。通道開放率(Po)

在30 s內，tj表示通道開放時間. N 活躍期開放通道數目。Td記錄時間，n通道數目。用如下公式測量藥物對通道活躍性影響

1.5 統計學方法

所有數據均已均數標準誤差表示，以SPSS 10.0統計軟件包進行統計學分析，采用配對t檢驗，P<0.05為統計學差異。

2 結果

2.1 分離小鼠心肌細胞的形態學特點

用急性酶解法分離的小鼠心肌細胞，在400倍光學顯微鏡下可觀察到有35%～45%的細胞是呈條柱狀，邊界清晰，橫紋排列清楚(圖1)。在本實驗中采用具有這些特征的細胞進行心肌細胞膜離子通道研究，發現封接成功率可達75%。

圖1 急性分離的心肌細胞形態

圖2 ATP敏感性鉀離子通道的確認

2.2 ATP敏感性鉀離子通道電流確認

當把無ATP實驗溶液灌流到單一心肌細胞外液中，利用膜片鉗制成膜內向外模式，當鉗制電壓-60 mV時，可出現激活的內向型電流通道。此時，當細胞外浴液中添加1 mmol/L ATP時，觀察到激活的通道活性逐漸減弱，1 min后無激活的通道。當把浴液換成無ATP的溶液時，通道活性增強，這時候在溶液中添加KATP抑制劑glibenclamide 50 μmol/L，通道活性再次減弱，1 min后通道活性將消失(圖2)。電流-電壓相關關系曲線顯示為內向定流性(inward rectification)，slope conductance為(62 ± 1.5)pS。維持-60 mV時，單位通道電流平均值為(3.7 ± 0.25)pA，單開一個通道的dwell time和通道活性成反比。從以上通道的特性來看，本研究的單一活性通道可確認為ATP-敏感性通道(KATP)。除了上述提到的特別情況，本研究的patch clamp實驗維持-60 mV電位時出現的內向電流為對象。

2.3 不同濃度雌激素對心肌細胞膜KATP通道影響

雌激素在人體內正常生理濃度男性為(40～115)ng/L，女性(61～350)ng/L。本實驗在鉗制電壓-60 mV細胞膜內向外記錄模式下，依據Boyan等[6]的報道，本實驗分別向浴液中加入低濃度(0.1 μmol/L)、中濃度(1 μmol/L)及高濃度(10 μmol/L)三種不同濃度雌激素觀對KATP通道的影響。觀察到兩種雌激素(17α-ethynylestradiol、 17β-estradiol) 均對KATP通道有抑制作用，且呈濃度依賴性，通道活性抑制率經pClamp7.0系統數據處理，其通道活性抑制的半數有效濃度分別為0.3 μmol/L 及 0.1 nmol/L(圖3)。

圖3 不同濃度雌激素對KATP離子通道的影響，半數有效濃度為0.3 μmol/L and 0.1 nmol/L

2.4 活化KATP通道早期雌激素對心肌KATP通道的影響

Pinacidil或2,4-dinitrophenol(DNP)均為細胞膜KATP離子通道開放劑的代表藥物，能使膜KATP通道活化，通過加強K+離子外流，降低心肌興奮性。在鉗制電壓-60 mV細胞吸附記錄模式下，向浴液中加入pinacidil或2,4-dinitrophenol (DNP)活化KATP通道后，觀察3 min，通道活性未見明顯影響(圖4)。

圖4 雌激素對活化后KATP離子通道早期的影響

2.5 PDBu預處理后，雌激素對心肌細胞膜KATP通道的影響

Phorbol 12,13-dibutyrate(PDBu)是蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)激動劑的代表藥物之一，可使細胞內蛋白激酶C發生活化。在鉗制電壓-60 mV細胞膜內向外記錄模式下，向浴液中加入PDBu 0.001 nmol/L進行預處理后，觀察到雌激素(10-8，10-3和1 μmol/L)對KATP離子通道活性的抑制作用發生明顯減弱(圖5，圖6)。

圖5 雌激素對PDBu預處理后KATP離子通道的影響

圖6 不同濃度雌激素對不同濃度PDBu抑制下KATP通道的影響

3 討論

KATP離子通道廣泛分布于心肌細胞、血管與非血管平滑肌細胞和神經細胞等多種細胞中。心肌細胞中KATP屬于一種內向整流型鉀通道。其開放狀態主要受細胞內ATP濃度的影響，在一般正常生理情況下KATP通道處于關閉狀態，但在某些病理情況下該通道被激活，開放的 KATP通道通過影響細胞的興奮性使動作電位時程縮短，減少鈣內流，減輕心肌缺血時的鈣超載，保存細胞內ATP，從而發揮心肌保護作用[7-8]。相反在心肌缺血缺氧的情況下，KATP離子通道的持續性開放反而會導致細胞外鉀離子積聚，減慢心臟的興奮性傳導，從而誘發嚴重的室性心律失常，嚴重者能夠引發室顫。

雌激素是一類G18類固醇激素，主要成分為雌二醇，有α和β兩種類型。目前研究多數認為雌激素主要可以通過兩種途徑發揮作用：一是通過激活細胞核受體使轉錄因子調控相關基因的表達，如抗凋亡基因BCL-2等[9]。一種是通過激活膜受體激活相關的酶和離子通道，調節下游信號通路中的蛋白質轉錄后的修飾從而產生效應[10]。有研究報道早期雌激素可增加大鼠KATP通道的蛋白表達減輕缺血再灌注損傷[11-12]，還可以通過抑制細胞內超氧化物歧化酶活性，提高抗氧自由基能力、抑制炎癥因子、減小心肌梗死面積、減少心肌細胞凋亡，減輕大鼠在體心臟缺血再灌注損傷[13]。本試驗采用膜片鉗技術觀察雌激素對KATP離子通道的影響，發現雌激素在膜內向外膜片鉗模式中可抑制KATP離子通道活性呈濃度依賴性。結果表明，雌激素也可通過降低KATP通道的活性，使細胞外鉀離子積聚減弱，延長動作電位時程，減弱心肌細胞不應期離散度，降低誘發室性心律失常的機率，從而發揮保護心臟的作用。

當機體發生缺血后，機體首先可以通過各種體液調節及自身調節方式來改善心肌細胞的缺血產生的損傷。現今研究認為KATP通道及蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)也都通過改善缺血引起的心肌損傷，從而起到保護心肌的作用[14-15]。實驗結果表明，當給與心肌細胞PKC激活劑(PDBu)預處理后，雌激素對心肌KATP通道活性的抑制作用明顯發生減弱。當細胞內有第二信使存在時(如Ca2+，cAMP等)，PKC可以作為一種與膜結合的酶，活化Na+-K+交換系統，提高細胞內K+濃度。因此可推測當心肌細胞發生缺血后，可能由于細胞內PKC活化增強，使得雌激素對心肌細胞的保護作用發生了明顯的減弱，從而增強了誘發室性心律失常的機率。

綜上所述，本研究通過運用膜片鉗技術觀察雌激素對心肌細胞KATP離子通道的影響，及與PKC的關系作了初步探討，揭示了雌激素可通過影響心肌細胞KATP通道活性防止心律失常的產生，但雌激素與PKC蛋白調控抑制的關系還有待進一步研究。

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