丹紅注射液對Beagle犬的13周亞慢性毒性試驗

遲福艷， 薛 云，戴學棟，馬玉奎

(1.山東省臨朐縣人民醫院，山東 262600；2.山東省藥學科學院，濟南 250033)

人們普遍認為中藥的藥性平和、不良反應小、安全可靠。但隨著中藥新品種及新劑型不斷出現，特別是中藥注射液的廣泛應用，其不良反應也日益突出，漸漸引起人們的重視。中藥注射劑成分往往復雜，所引起的不良反應也不能準確發現引起的機制。鑒于近年臨床上中藥注射劑引發的不良反應事故頻發，為全面提高中藥注射劑的安全性、有效性和質量可控性，SFDA下發了《關于開展中藥注射劑安全性再評價工作的通知》(國食藥監辦〔2009〕28號)。按照SFDA的要求，我們在GLP條件下對丹紅注射液進行了臨床前安全性再評價研究。本試驗通過觀察13周重復靜脈給予丹紅注射液后Beagle犬所產生的毒性反應，預測臨床用藥中可能出現的不良反應，提示臨床用藥中需重點監測的指標，為臨床用藥的安全性提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環境

Beagle犬，合格證號：SCXK(京)2011-0003，雌雄各半，體重范圍為(6～8)kg，由北京瑪斯生物技術有限公司提供。飼養于普通級環境，室溫(19～26)℃，濕度40%～70%，日溫差≤4℃，換氣次數8～10次/h，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。實驗動物使用許可證號：SYXK(魯)20100004。

1.2 儀器與試劑

BS300型生化分析儀(深圳邁瑞公司制造)，用于血液生化學檢測。C2000型血凝儀(北京東方普利生制造)，用于血液學檢測。TCS-150型電子臺秤(精確到0.01 kg，梅特勒-托利多儀器(常州)有限公司制造)，用于動物體重測定。TP1020生物組織脫水機、EG1160石蠟包埋機、RM2235切片機、DMLS2型顯微鏡(德國萊卡公司制造)，以上儀器用于組織病理學檢查。

丹紅注射液(濃縮液)由濟南步長制藥有限公司提供，每1 mL中含總黃酮以蘆丁計為49.4 mg/mL(批號110511)；血液學檢測試劑盒，由煙臺卓越生物技術有限責任公司生產。血凝檢測試劑盒由德國Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH生產。血液生化學檢測試劑盒由邁瑞上海科華生物工程股份有限公司生產。

1.3 方法[1]

按照中藥注射劑安全性再評價非臨床研究評價技術原則要求，亞慢性毒性試驗應采用嚙齒類和非嚙類兩種動物；對于丹紅注射液的大鼠亞慢性毒性研究已有報道[2]，但未見非嚙齒類毒性研究，故本試驗采用檢疫合格的Beagle犬24只，雌雄各12只，按體重均衡原則分為4組，即溶劑對照組和丹紅注射液3個不同劑量給藥組(494，247，124 mg/kg)，給藥容積為10 mL/kg，對照組同法給予10 mL/kg的生理鹽水，每天1次給藥，每周給藥6 d，停藥1 d，給藥周期為13周，恢復期設為4周。

1.4 劑量設計依據[1]

中藥、天然藥物長期毒性試驗技術指導原則中規定，長期毒性試驗高劑量原則上使動物產生明顯的毒性反應，低劑量原則上高于動物藥效學試驗的等效劑量、并不使動物出現毒性反應，結合毒性作用機制和模式在高劑量和低劑量之間設立中劑量，以考察毒性反應劑量-反應關系。

丹紅注射液臨床用藥劑量以蘆丁計為7.5 mg/kg，折算為犬的等效劑量為12 mg/kg。同時，Beagle犬急毒結果顯示，667 mg/kg劑量給藥后，Beagle犬出現嘔吐、呼吸急促、后肢無力，活動減少等毒性反應，約(4～8) min恢復正常，445 mg/kg劑量給藥后犬出現后肢無力和活動減少等毒性反應，約2 min恢復正常，296 mg/kg劑量給藥后犬未出現任何毒性反應。參考急毒結果，按照技術指導原則要求，將494 mg/kg設計為亞慢性毒性試驗的高劑量，此劑量為臨床劑量的66倍，藥效學等效劑量的41倍，124 mg/kg為低劑量，為臨床用藥劑量的16倍，藥效學等效劑量的10倍。

2 結果

2.1 一般體征觀察

高劑量組所有動物給藥過程中均出現流涎和嘔吐反應；中劑量組所有動物出現流涎，2只動物偶爾出現嘔吐反應；低劑量組和溶劑對照組所有動物均未見任何異常反應。

2.2 體重變化

與溶劑對照組比較，494 mg/kg劑量組動物體重增長率明顯偏低，在第1、2周出現統計學差異(P<0.05)，說明丹紅注射液494 mg/kg劑量下可抑制Beagle犬體重增長；247 mg/kg和124 mg/kg劑量對Beagle犬體重無明顯影響。見表1。

表1 丹紅注射液對Beagle犬體重增長率的影響

2.3 血液學及血液生化學結果

參考本中心Beagle犬的背景數據及相關文獻[3]，并與溶劑對照組比較，丹紅注射液所有劑量組的血液學、心電等指標未見任何異常；TT、PT和TT明顯延長，高劑量組動物血清中BUN和CR明顯升高，出現統計學差異(P﹤0.05或P﹤0.01)；其它兩個劑量組血液生化學指標基本在正常范圍內。高劑量組動物血清中BUN和CR的升高停藥4周后可恢復正常。給藥結束時出現統計學意義的指標結果如表2所示。

表2 Beagle犬異常的血液學及血液生化學指標

2.4 病理組織學檢查結果

丹紅注射液高、中、低三個劑量組所有動物臟器重量均在正常范圍內，各臟器未見肉眼可見病變。病理檢查結果顯示，494mg/kg劑量組50%動物肝臟枯否氏細胞增生，胞質內可見棕黃色顆粒；溶劑對照組及中、低劑量組所有動物所有臟器均未見藥物相關性病理組織學病變(圖1見彩插1)。

3 討論

尿素氮(BUN)是人體蛋白質代謝的主要終末產物，腎臟為排泄尿素氮的主要器官；肌酐(CR)是肌酸和磷酸肌酸代謝的終產物，它的排泄量反映血液中的肌酸酐含量和腎小球的過濾速率，也就是腎臟的機能，當腎發生病變時，肌酐排泄受阻，血液中肌酸酐含量升高。通過測定血液中肌酐和尿素氮含量的測定，可檢測腎功能是否異常[4，5]。本研究中，高劑量組Beagle犬血清中BUN和CR明顯升高，表明丹紅注射液494 mg/kg劑量下對腎臟功能有明顯的損傷，病理學檢查結果顯示，未見明顯的組織病理學病變，說明對腎臟的損傷僅僅是功能性損傷，并未有實質性病變。活血化瘀類藥物可引起凝血時間延長，本試驗中，犬血液的PT(凝血酶原時間)、APTT(活化部分凝血活酶時間)和TT(凝血酶時間)明顯延長，分析原因為丹紅注射液具有活血化瘀作用，凝血時間的延長為丹紅注射液的藥效作用，無毒理學意義。病理學檢查結果顯示，高劑量組50%動物肝臟枯否氏細胞增生，胞質內可見棕黃色顆粒，分析原因為丹紅注射液自靜脈進入動物體內后，作為異物可能會激活肝臟的單核-巨噬細胞系統，使巨噬細胞增生，繼而吞噬異物顆粒，直至清除。

Beagle犬亞慢性毒性試驗可描述犬重復給予供試品后的毒性反應，是非臨床安全性評價的重要內容，也是中藥注射液再評價必須進行的研究項目。通過亞慢性毒性試驗可以預測藥物可能引起的臨床不良反應的性質、程度、量效關系和時效關系、可逆性等；也可判斷藥物可能的毒性靶器官或組織，推測臨床用藥的安全范圍，指導臨床安全用藥。本研究結果顯示，丹紅注射液靜脈注射給藥，其無毒反應劑量為124 mg/kg，其主要的中毒靶器官為肝

臟和腎臟等，提示臨床應用中應密切監測患者以上器官的功能。

參考文獻：

[1] 中藥、天然藥物長期毒性試驗技術指導原則[S]. 國家食品藥品監督管理局頒發, 2005, 3.

[2] 王保中, 曹茂榮, 鄒薇紅, 等. 丹紅注射液毒理學研究[J].中國實用醫藥，2008, 3(11):27-29.

[3] 楊鋒, 王紅星, 何永亮, 等. 實驗Beagle犬血液學及血液生物化學參考值的探討[J]. 中國比較醫學雜志, 2004, 14(6):355-358.

[4] 周宗燦. 毒理學教程[M]. 北京大學醫學出版社, 2006: 425-427.

[6] 任麗, 蔣素華, 劉紅, 等. 血肌酐水平、MDRD-GRF、CG-GRF與腎小管間質病變相關性研究[J].檢驗醫學與臨床, 2010,22(7):2436-2438.