小鼠諾如病毒間接免疫熒光檢測方法的建立

田勝男，佟 巍，張麗芳，常 慧，李雨函，蘇靜芬，劉先菊，向志光，劉云波

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

諾如病毒(Norovirus, NoV)屬杯狀病毒，是全球流行性與散發性急性胃腸炎的主要病因之一，每年至少導致100萬例病患就診和20萬例5歲以下兒童死亡，造成巨大的經濟損失[1]。由于缺少合適的體外培養模式和小動物模型，使該病毒的研究受到了很大限制。小鼠諾如病毒的發現及其能夠在體外細胞中培養的特性，使它成為了良好的NoV研究模型[2]。小鼠諾如病毒在實驗小鼠中的感染率非常高，我國已有多個實驗動物設施檢出小鼠感染該病毒的情況。

間接免疫熒光法基于抗原-抗體反應，以全病毒作為抗原識別血清中存在的病毒抗體，因而具有高特異性[3]，該方法在實驗小鼠病毒檢測中應用非常廣泛，多種病毒都能夠通過這種方法進行快速檢測。本實驗旨在建立小鼠諾如病毒間接免疫熒光檢測方法，實現MNV高效快速檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

RAW264.7細胞和MNV-1(CW1)購自ATCC，Manassas, VA；Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM)購自Thermo Scientific，Hyclone；四周齡Balb/c小鼠(SPF級)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，感染動物實驗得到中國實驗動物學會實驗動物使用和管理委員會許可(ILAS-PC-2013-005)；小鼠諾如病毒ELISA檢測試劑盒(SMART-M35)購自Biotech Trading Partners公司。熒光顯微鏡：Nikon, Ni-U；醋酸纖維素膜：Millipore, Bedford, USA；多通道雜交儀：AE-6195, ATTO, Tokyo, Japan；山羊抗小鼠IgG: Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA (1:10000用)；化學發光試劑(ECL)：Millipore, Bedford, USA；X-ray 膠片：Kodak, Rochester, USA。

1.2 MNV-1的富集

取0.2 mL MNV-1，加入生長密度為80%左右的單層RAW264.7細胞，37℃吸附1 h，加6 mL DMEM(含0.5%雙抗)，37℃, 5% CO2繼續培養。觀察細胞生長情況。分別取不同培養時間點的細胞反復凍融3次，2 500 r/min離心5 min，收集上清液。

1.3 TCID50法測定病毒效價

在離心管或12孔細胞培養板中將病毒液作連續10倍的稀釋，稀釋度從10-1～10-10。將稀釋好的病毒懸液接種到鋪滿單層細胞的96孔微量培養板中(細胞密度約為2～3×105個/mL)，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100 μL。設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排(100 μL生長液)。逐日觀察并記錄結果，連續觀察7 d。按Reed-Muench兩氏法計算結果。

1.4 血清樣品的收集

取四周齡BALB/c 小鼠(SPF級)進行眼眶采血，收集血清作為陰性對照。其他小鼠通過灌胃的方式感染MNV-1(107TCID50)，200 μL/只[4]。取感染后7周內不同時間點的小鼠血清進行檢測。

1.5 免疫熒光分析抗體檢測

1.5.1 抗原片的制備：選擇效價為107TCID50的病毒接種于RAW264.7細胞，收集感染后不同時間細胞，滴加至玻片上，作為抗原孔。未感染的RAW264.7細胞作為對照孔。室溫晾干，將玻片浸入4℃預冷的丙酮中固定15 min，固定后通風使丙酮揮發。抗原玻片-30℃保存。

1.5.2 檢測步驟：所有的血清樣品于56℃,滅活30 min，待檢血清用磷酸緩沖液(pH 7.2)1∶10稀釋樣品。每個樣品滴加2個孔(一個抗原孔，一個對照孔)。樣品滴加完畢后將玻片放入濕盒內37℃孵育30 min。取出玻片，PBS沖洗3次，每次5 min。抗原玻片風干后，逐孔滴加熒光結合物，放入濕盒內37℃孵育30 min。PBS沖洗1次，蒸餾水沖洗1次。50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 ELISA試劑盒對小鼠血清的檢測

對收集的所有血清進行ELISA檢測(過程參照說明書)，選擇強陽性血清作為陽性對照。

1.7 Western blot法對差異樣品的驗證

對兩種方法檢測的結果不一致的血清，用Western blot的方法進行驗證。按1.2方法對MNV-1進行富集后，30 000 r/min，3 h超速離心，PBS重懸沉淀，NanoDrop 2 000測定蛋白濃度；制備SDS-PAGE凝膠，每孔上樣5 μL，恒流100 V電泳2 h，電泳結束后立即轉膜，恒流300 A，1 h將蛋白轉移至醋酸纖維素膜(NC)上，3%脫脂奶粉封閉1 h，將差異血清1∶100稀釋后孵育NC雜交膜，4℃過夜，PBST(PBS含0.05%吐溫)洗膜3次，每次10 min，山羊抗小鼠IgG 1∶10 000稀釋后 37℃孵育NC雜交膜1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，暗室顯影。

2 結果

2.1 不同培養時間收集病毒的滴度

對感染MNV-1后不同時間點的RAW264.7細胞進行病毒收集并測定其效價，結果顯示在培養前期病毒感染細胞以及初始復制較慢需要6～8 h左右，病毒滴度僅為102TCID50，隨后的24～28 h病毒滴度呈對數增長趨勢，隨著時間的增加，病毒效價明顯增強，培養時間增至36 h時病毒效價達到峰值，隨后的幾小時內病毒滴度無上升趨勢，此時感染細胞基本呈破碎或半破碎狀態(圖1)。

使用24孔細胞培養板，以2 h為間隔，收集病毒感染后2 h、8 h、12 h、16 h、20 h、22 h、24 h、36 h、48 h共9個時間點的感染細胞爬片，分別檢測MNV陽性血清并比較結果。全視野觀察36 h陽性細胞數可至50%，視野中細胞形態清晰，熒光強度高，便于觀察。選擇感染病毒36 h的細胞用于IFA 檢測。

注：RAW264.7細胞感染MNV-1后不同時間點收集病毒并測定其效價，結果顯示在培養8 h后為102pfu,隨著時間的增加，病毒效價也逐漸增強，培養時間增至36 h時病毒效價達到峰值。

2.2 IFA方法對血清樣品的檢測

IFA結果顯示小鼠感染MNV-1 7 d內血清樣品均為陰性，全視野下無熒光可見；感染后兩周時有陽性血清檢出，視野下偶見微弱熒光，多存在于胞漿處，呈顆粒狀；3周后全部血清樣品均為陽性(表1)。圖2為MNV免疫熒光法檢測血清樣品熒光顯微鏡下效果圖，其中圖2(a)為典型陽性圖像，圖2(b)為典型陰性圖像(圖2見封底)。

表1 IFA法對小鼠感染MNV-1后不同時間血清檢測結果

表2 ELISA法對小鼠感染MNV-1后不同時間點血清檢測結果

2.3 ELISA 試劑盒對血清樣品的檢測

圖3 ELISA法對小鼠感染MNV-1后不同時間血清檢測結果

取不同感染時間的小鼠血清進行ELISA檢測(每個時間點采5只小鼠血清樣品)，統計其吸光值(表2)，根據吸光值的結果計算出血清中抗體存在情況。小鼠感染MNV-1 16 h后，血清中的MNV-1抗體明顯增加，感染后兩周時血清可判定為陽性，感染3周后，血清中抗體達到峰值，隨后有微弱的下降，4～7周數值無明顯變化(圖3)。

2.4 IFA法與ELISA法檢測結果對比

分別用IFA法與ELISA法檢測80份小鼠血清，IFA法測定陽性27份，陰性53份，ELISA法測定陽性32份，陰性48份。差異樣品用Western blot法進行驗證，結果顯示，5份差異血清中3份血清為弱陽性，2份為陰性。兩種結果對比顯示IFA法檢測符合率為96.0%，ELISA法符合率為97.5%。

3 討論

隨著對小鼠諾如病毒的認識逐漸加強，越來越多的設施中檢出到實驗小鼠感染諾如病毒的情況。北美、歐洲、亞洲(韓國和日本)等地區均有實驗小鼠感染MNV的報道，相關報道也見于我國上海、廣東等地區。研究表明小鼠諾如病毒能夠使小鼠發生一系列的炎癥反應甚至死亡。因此，在進行實驗研究的過程中，排除小鼠諾如病毒的干擾，保證實驗結果的準確性非常必要[5]。

針對小鼠諾如病毒的檢測，酶聯免疫吸附試驗法試劑盒已經商品化，其快速準確的特點收到多個實驗動物使用單位青睞，但其特異性較差。常規PCR法及也能夠有效的檢出小鼠諾如病毒的存在，尤其是real-time PCR的靈敏度可以達到幾十個甚至十幾個拷貝數[6]，由于不同種類的小鼠諾如病毒序列間存在一定的差異，real-time PCR作為一種高度特異的檢測方法，可能無法同時滿足多種小鼠諾如病毒的檢測。

間接免疫熒光法是一種非常傳統的病毒檢測方法，在免疫學、生物化學和熒光顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項標記檢驗技術，檢測時間短、操作容易、特異性好。檢測抗原是采用胞內全病毒，具有較高的特異性不，但其靈敏度略有不足。ELISA法靈敏度高，對血清樣品的要求也高，微溶血或有其他雜微生物的污染對檢測結果都有非常大的影響。

綜上所述，IFA法和ELISA法雖然都能夠對小鼠諾如病毒進行常規檢測，但這兩種方法都不能夠完全真實的反應出小鼠的感染情況，在對設施中的實驗小鼠進行MNV排查時，建議采用IFA法或ELISA法作為初篩方法，對結果可疑的樣品，可采用Western blot法進行驗證，才能夠得出真實可靠的結果。

參考文獻：

[1] Patel MM, Widdowson MA, Glass RI, et al. Systematic literature review of role of noroviruses in sporadic gastroenteritis [J]. Emerg Infect Dis, 2008, 14(8):1224-1231.

[2] Wobus CE, Thackray LB, Virgin HW IV. Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis [J]． Virology, 2006, 80(11):5104-5112．

[3] Ison CA, Tanna A, Easmon CSF. Evaluation of a fluorescent monoclonal antibody reagent for identification of cultured Neisseria gonorrhoeae [J]. Med Microbiol, 1988, 26(2):121-123.

[4] Vashist S, Urena L, Goodfellow I. Development of a strand specific real-time RT-qPCR assay for the detection and quantitation of murine norovirus RNA [J]. J Virol Methods, b2012, 184( 1-2):69-76．

[5] 田勝男, 劉云波. 鼠諾如病毒概述 [J]. 中國比較醫學雜志, 2013, 23(7):68-71.

[6] 白露 葉偉, 于蒙蒙, 等. 兩種方法檢測漢坦病毒滴度的比較研究 [J]. 科學技術與工程, 2012, 12(9):2137-2141.