磁共振示蹤法定量測量大鼠C6膠質瘤模型細胞外間隙擴散參數

左 龍，趙 越，李懷業,李 凱,盧嘉賓，韓鴻賓

(1. 北京大學第三醫院放射科，北京 100191; 2.磁共振裝備與技術北京市重點實驗室, 北京 100191; 3.大連大學化學與化學工程學院，大連116622; 4.北京積水潭醫院放射科，北京 100035)

膠質瘤是最常見的原發性腦腫瘤，占惡性腦腫瘤的81%[1]。膠質瘤通常會導致顯著的致殘率和死亡率。在過去的幾十年中，治療方法不斷改進。目前，放療聯合化療是手術后的一線輔助治療[2]。然而，幾乎所有的膠質母細胞瘤患者在7～10個月無進展生存期中位期后都會出現病情進展[3]。因此，膠質母細胞瘤總體上難治且預后差。實際上大多數化療藥物不能通過血腦屏障，因而藥物到達腫瘤靶點的效率低下[4]。研究人員相繼發明了諸多新的治療策略，其中局部給藥可以直接繞過血腦屏障。局部給藥具體包括，局部注射、對流增強給藥和各種埋置多聚物。局部給藥可以將高生物利用度的制劑直接作用于靶點，而且幾乎沒有藥物損耗[5]。然而，溶液回流和水腫等多種副作用阻礙了對流增強給藥(CED)發展成一個用于神經膠質瘤的標準治療系統[6].

為克服上述缺陷，人們建立了一種磁共振實時成像的方法來監測給藥過程[7-9]，但卻沒有定量計算局部擴散和清除參數。本課題組首先應用磁共振示蹤技術定量測量了正常大鼠腦尾狀核、丘腦、枕葉皮質和黑質的擴散和清除參數[10，11]。本研究首次應用磁共振示蹤技術定量比較了C6膠質瘤10 d模型和20 d模型擴散和清除參數的差異，并且對影響擴散和清除的細胞外基質成分進行了免疫組化和蛋白質印跡分析比較。

1 材料和方法

1.1 溶液制備和實驗動物

用雙蒸水稀釋釓二乙三胺五乙酸 (Gd-DTPA，馬根維顯，拜耳先靈制藥，德國) 至10 mmol/L。本研究方案獲得了北京大學醫學部動物倫理委員會的批準(批號 No. LA2012-016)。16 只成年雄性 SD 大鼠，清潔級，體重(250～300)g，北京大學醫學部實驗動物科學部提供，實驗動物生產許可證號 SCXK( 京) 2011-0012。實驗動物使用許可證號：SYXK(字)2011-0039。隨機分為兩組： 10 d膠質瘤組(n=8)和20 d膠質瘤組(n=8)。C6大鼠膠質瘤細胞系(ATCC No. CCL 107) 培養如以往報道。大鼠(n=8)經腹膜內注射戊巴比妥鈉、乙醇、水合氯醛、硫酸鎂和丙二醇混合物(3 mL/kg)麻醉后，固定于立體定位儀(Stoelting, 美國)。在頭皮沿矢狀縫從兩耳間區域至兩眼間區域做正中切口，小心分離腦膜暴露前囟。右側顱骨表面定位鉆孔 (前囟前，1 mm；右旁開，3.5 mm)。C6細胞懸液(5 ×106cells in 10 μL)經顱骨孔緩慢注入(10 min)右側尾狀核 (前囟前，1 mm；右旁開，3.5 mm；深，5.0 mm)。微量進樣器停針5 min。顱骨孔用骨蠟封閉，頭皮縫合。

1.2 MRI示蹤法示蹤大鼠C6膠質瘤模型細胞外間隙擴散

大鼠麻醉如前所述，實驗過程中適時追加保持麻醉狀態(約為 0.7 mL/kg/h)。大鼠置于加熱墊(38 ± 0.5)°C上保持體溫。預掃描將大鼠置于西門子磁共振成像(Magnetom Trio，Germany)系統腕線圈中, 用 T1 加權三維磁化準備快速采集梯度回波序列(T1 3D MP-RAGE)掃描[12]。獲得用于圖像后處理的預掃描圖像并用于確定穿刺位點。大鼠顱頂備皮，碘伏消毒。沿矢狀縫從兩耳間區域至兩眼間區域開頭皮，小心分離腦膜暴露前囟。將大鼠置于立體定位儀上, 根據 MRI 預掃描結果顯示的腫瘤生長情況在顱骨表面重新定位鉆孔，向腫瘤中心區域微量注射10 mmol/L Gd-DTPA 溶液 2 μL(注射時間 10 min)。注射 Gd-DTPA 后不同時間點,15min、30 min、第1、2、3、4、5、6小時行磁共振掃描成像。成像序列和參數如前所述。

1.3 圖像后處理和參數計算

用 MATLAB7.8 軟件(MathWork, 美國)將注射后掃描圖像與預掃描圖像配準后獲得減影圖像[13]。本課題組前期研究中，已經發現了3.0T磁共振機應用T1加權3D MP-RAGE序列掃描的Gd-DTPA濃度與信號強度增量(ΔSI)的線性關系[12]。與以往的1/T1值與Gd-DTPA濃度關系相比更有利于實時成像計算[14-16]。MRI示蹤法定量細胞外間隙擴散的主要參數包括自由擴散系數 (D)，有效擴散系數(D*)，迂曲度 (λ)和清除速率常數(k’). 根據本課題組已經報道的方法進行參數計算[17]。為測量腦組織間液流動參數半衰期(thalf-life)，將高于背景噪音兩個標準差的的信號強度作為閾值，逐層提取感興趣區內的所有像素得到各掃描時間點Gd-DTPA總量(Gdsum)。由于Gd-DTPA在腦內按一級動力學常數清除，Gd-DTPA的半衰期可以通過曲線擬合得到(Gdsum=e-kt)，其中半衰期(thalf-life)根據thalf-life=ln(2/k)進行計算。

1.4 免疫組化

選取典型的細胞外基質大分子進行免疫組化分析[18-20]。5 μm石蠟切片脫蠟后，3%過氧化氫避光浸泡，抗原熱修復。分別滴加抗硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C、IV型膠原蛋白一抗(兔抗大鼠；1∶200；博奧森)，4℃過夜；加二抗常溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染細胞核。

1.5 蛋白質印跡(Western blotting)

將上述大分子用蛋白質印跡法進行檢測[21-23]。腫瘤組織取材，加入裂解液勻漿后離心，各取上清液50 μg點樣于12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉印至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶封閉。分別用硫酸軟骨素蛋白多糖抗體、腱生蛋白C抗體、抗IV型膠原蛋白(兔抗大鼠；1∶1 000；博奧森)或抗GAPDH(1∶10 000; 博奧森) 4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，洗膜后加入免疫印跡化學發光檢測試劑( enhanced chemiluminescence，ECL)，X光膠片曝光，ImageJ軟件(國立衛生院，美國)分析。以GAPDH蛋白作為系統內參，測定條帶進行灰度值，以目的/內參比值來比較表達的差異。

1.6 統計學方法

統計分析采用SPSS軟件19.0版本進行 (IBM，美國)。所有結果均用均值±標準差(SD)的形式表示。用獨立樣本t檢驗比較兩組樣本的有效擴散系數(D*)，迂曲度(λ)，清除速率常數(k’)和半衰期(thalf-life)。用配對樣本t檢驗比較兩組樣本的蛋白印跡分析。P值小于0.05(P<0.05)為有統計學差異。

2 結果

2.1 膠質瘤10d模型和膠質瘤20 d模型Gd-DTPA擴散參數和半衰期的比較

MRI矢狀位、橫軸位和冠狀位三個方向顯示不同時間點Gd-DTPA的擴散過程(圖1和2); Gd-DTPA導入細胞外間隙后，局部信號強度增高，隨后信號強度隨時間衰減至示蹤劑從細胞外間隙中清除。20 d膠質瘤有效擴散系數(D*)明顯小于10 d膠質瘤((6.67±1.78) ×10-5mm2/s vs. (1.26±0.27) ×10-4mm2/s; t=4.265;P<0.01)，導致迂曲度(λ)增大 (λ=(D/D*)1/2)((3.99±0.57) vs. (2.83±0.29);t=4.11;P<0.01) (圖3A)。測量清除速率常數(k’)，20 d膠質瘤((7.67±2.29) ×10-5mm2/s) 小于10 d膠質瘤 ((1.46±0.36) ×10-4mm2/s)，差異有統計學意義(t=3.87;P<0.05)(圖3A)。10d膠質瘤半衰期(0.86±0.23 h)顯著小于20 d膠質瘤(1.64±0.12 h) (t=5.91;P<0.01)(圖3B)。

注1：(A)矢狀位；(B)橫軸位；(C)冠狀位

注2：(A)矢狀位；(B)橫軸位；(C)冠狀位。

2.2 膠質瘤10 d模型和20 d模型細胞外基質表達的差異

注3：(A)擴散參數定量分析(D*,λ,k’) (B)Gd-DTPA的半衰期擬合曲線圖。(C)膠質瘤10 d模型半衰期與膠質瘤20 d模型半衰期統計分析(thalf-life)，** P<0.01。

為了更好地理解上述擴散參數(D*, λ 和k’)和半衰期(thalf-life)的差異，我們用免疫組化法觀察到20 d膠質瘤中硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C和IV型膠原蛋白的表達(圖4B, 4D和4F)均較10 d膠質瘤的表達(圖 4A, 4C和4E，圖4見封三)增高。Western blotting的定量結果進一步證實了這些發現。硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs/GAPDH)(圖 5A)在20 d膠質瘤中(0.48±0.07)的表達均高于在10 d膠質瘤中(0.32±0.09)的表達(t=4.663；P<0.01)，腱生蛋白C(Tenascin-C/GAPDH)亦然((0.29±0.04)vs.(0.58±0.11)；t=6.50;P<0.01)(圖5B)。20 d膠質瘤中IV型膠原蛋白(collagen IV/GAPDH)(圖5C)的含量也高于10 d膠質瘤((0.24±0.07)vs.(0.33±0.06)；t=3.81；P<0.05)。

3 討論

眾所周知，磁共振擴散加權成像(diffusion-weighted MRI)是一種能夠測量組織內水分子擴散的成像技術，是腦腫瘤分級和判斷放化療療效方面的研究熱點[24-27]。但是由于擴散加權成像并不能區分細胞內和細胞外的擴散且空間分辨力低，因而難以用于指導腦內局部給藥[28]，實時磁共振示蹤技術應運而生。

本研究應用磁共振示蹤法定量研究了膠質瘤模型在生長的第10天和第20天腫瘤細胞外間隙的有效擴散系數(D*)，清除速率常數(k’)和半衰期(thalf-life)等方面表現出了顯著的差異。這兩個時期的膠質瘤細胞外擴散和清除的所具有的不同特征與膠質瘤細胞外基質的不同相關。20 d膠質瘤細胞外基質成分如硫酸軟骨素蛋白多糖，腱生蛋白C和IV型膠原蛋白的增多，與20 d膠質瘤有效擴散系數、清除速率常數的較小和半衰期的延長相對應。

注5：(A) 硫酸軟骨素蛋白多糖Western blot分析；(B) 腱生蛋白C Western blot分析；(C) IV型膠原蛋白Westernblot分析；** P<0.01,* P<0.05.

通常，腫瘤體積的增大是腫瘤進展的重要標志[29]。腫瘤細胞植入后，腫瘤體積隨時間逐漸增大，即為腫瘤進展[30]。腫瘤細胞外間隙的擴散對于腫瘤細胞攝取營養物質，和抗腫瘤藥物到達治療靶點作用于腫瘤都至關重要[31]。細胞外基質成分是影響腦腫瘤細胞外間隙擴散的重要因素之一[32， 33]，可以增加細胞外間隙粘滯度，降低擴散速率[34]。細胞外基質的存在增加了分子運動的粘滯阻力，使細胞外間隙不再是自由擴散介質[35]。以往文獻報道，硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C和IV型膠原蛋白在膠質瘤細胞外間隙中高表達，并隨著腫瘤生長進展含量逐漸升高[22， 36-40]。本研究的結果與以往文獻報道一致。腦細胞外間隙占腦容積的20%，腦細胞間約50 nm的空隙內含細胞外基質[41， 42]。目前認為細胞外基質成分可降低溶質分子或膜相關分子的擴散[34]。膠質瘤細胞外基質分子種類較多，主要包括蛋白多糖、糖蛋白、膠原纖維等成分[43]。本研究中的硫酸軟骨素蛋白多糖，腱生蛋白C和IV型膠原蛋白分別是上述三種主要成分的典型代表分子，在ECS中含量較高，參與構成膠質瘤細胞生長的微環境，并影響膠質瘤細胞的進展轉移等生物學行為，而受到廣泛關注[36]。另外由于幾種成分之間往往相互連接構成復合結構[43]，所以選取典型細胞外基質分子有助于對于膠質瘤細胞外間隙的分析。本研究局限性在于只是選取了典型的細胞外基質分子，未來需要對于細胞外基質的各種分子對擴散的影響進行更全面的研究，并進一步對不同類型膠質瘤擴散參數和細胞外基質的表達進行定量研究。

腫瘤分期是腫瘤學研究的基本內容之一。國際抗癌聯盟 (UICC) 美國癌癥聯合會(AJCC) 的TNM分期系統[44]是五十多年來評估腫瘤患者預后的參考[45]。但是自第五版以來，TNM分期已不再包含原發性腦腫瘤的內容[44]。目前使用的是世界衛生組織(WHO)分類標準，將原發性腦腫瘤分為星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤和混合型膠質瘤[46]。有學者認為將腫瘤體積、浸潤情況和淋巴結轉移等考慮在內可將腫瘤進一步分期[47]，并認為T分期(腫瘤大小)是制定各期神經膠質瘤治療方案的重要參考[48]。在我們的研究中發現兩個時期的膠質瘤擴散參數明顯不同，提示局部給藥參數應根據腫瘤進展情況進行調整。

局部給藥是治療惡性膠質瘤的新方法和新希望。實時MRI示蹤技術將有助于我們更好地研究膠質瘤細胞外間隙擴散的生物學基礎，有助于惡性膠質瘤局部治療的發展。

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