樹鼩腺病毒(TAV)PCR方法的建立及初步應(yīng)用

王淑菁，付 瑞，李曉波，王 吉，衛(wèi) 禮，鞏 薇，賀爭(zhēng)鳴，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所；國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心，北京 100050)

樹鼩(tree shrew,Tupaiabelangeri)，屬于攀鼩目樹鼩科，主要生活在熱帶和亞熱帶森林、灌叢、村落附近，在東南亞和我國(guó)云南、廣西、海南、貴州等地有較多分布。樹鼩被認(rèn)為是靈長(zhǎng)類最親密的近親，已有報(bào)道表明樹鼩非常適合用于研究人體的近視、心理應(yīng)激和肝炎等問題[1]。因此，樹鼩作為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源越來越受重視。目前研究中使用的樹鼩大多來自野外或馴化后代，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量難以保證，其自然攜帶病毒尚不清楚。將野生樹鼩進(jìn)行人工馴化、飼養(yǎng)、繁殖與規(guī)范化管理，對(duì)其攜帶的病毒、細(xì)菌、寄生蟲指標(biāo)進(jìn)行控制，建立標(biāo)準(zhǔn)化的樹鼩種群勢(shì)在必行[2,3]。

腺病毒(adenovirus, ADV)屬于腺病毒科。迄今為止已發(fā)現(xiàn)至少100多種腺病毒可感染人、哺乳動(dòng)物和禽類。腺病毒可引起多種急性上呼吸道感染、急性眼結(jié)膜炎、急性出血性膀胱炎、腹瀉等[4]。80年代以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從野生樹鼩的咽拭子、腎組織培養(yǎng)物和糞便中分離出樹鼩腺病毒。目前尚未建立相應(yīng)的樹鼩腺病毒血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。因此，本研究將建立樹鼩腺病毒(TAV)PCR檢測(cè)方法，并進(jìn)行初步應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和毒種

由于目前無樹鼩腺病毒標(biāo)準(zhǔn)毒種及分離株，將構(gòu)建陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽性對(duì)照。查詢NCBI上樹鼩腺病毒(TAV)序列，選擇樹鼩腺病毒基因組保守特異區(qū)域(19418-19917區(qū)域)，委托Takara公司合成約500bp目的片段，插入pMD18-T載體，構(gòu)建陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。禽腺病毒I型(CELO VR-432株)購(gòu)買于ATCC，禽腺病毒III型(EDS AV127株)購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所。猴腺病毒-1和猴腺病毒-20均為本科室保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

使用primer 5軟件在TAV 19418-19917區(qū)域設(shè)計(jì)引物。上游引物:GCGGAGCGGGTTGTA GGGTA；下游引物:TCGTGCGGCTGGCGTTTT。委托Takara公司合成。

1.3 樣本采集及DNA提取

樣本均為云南來源樹鼩。無菌采集60份樹鼩EDTA抗凝血，使用Qiagen的 Dneasy Blood & Tissue Kit 試劑盒(Cat.No69504)提取血DNA。采集56份樹鼩糞便，使用Qiagen的DNA Stool Mini Kit的試劑盒(Cat.No51504)提取糞便DNA。詳細(xì)操作根據(jù)產(chǎn)品說明書。

1.4 PCR擴(kuò)增體系

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括：10 x PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ddH2O 17.35 μL，引物各1 μL，DNA 1 μL，HS Taq酶0.15 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，退火溫度 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳測(cè)定。PCR產(chǎn)物送Takara公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 特異性測(cè)定

將擴(kuò)增得到的目的片段測(cè)序，與NCBI序列比對(duì)確定是否為特異性片段。提取禽腺病毒I型、禽腺III型、猴腺病毒-1，猴腺病毒-20，考察該方法的特異性。

1.6 靈敏度測(cè)定

陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的DNA濃度為13.5 μg/mL，將其倍比稀釋從13.5 ×100至13.5 × 10-9μg/mL，以考察該P(yáng)CR方法的靈敏度。

1.7 初步應(yīng)用

使用該P(yáng)CR方法檢測(cè)60份樹鼩血DNA及56份樹鼩糞便DNA。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系的建立

TAV經(jīng)特異性擴(kuò)增得到495 bp目的片段，將擴(kuò)增得到的目的片段經(jīng)測(cè)序后，與NCBI網(wǎng)站上的序列一致率為100%。

2.2 特異性測(cè)定

以禽腺病毒I型、禽腺III型、猴腺病毒-1，猴腺病毒-20做對(duì)照，結(jié)果顯示僅樹鼩腺病毒陽性質(zhì)粒擴(kuò)增得到495 bp目的片段(圖1)。

2.3 靈敏度測(cè)定

倍比稀釋樹鼩腺病毒陽性質(zhì)粒DNA，濃度從13.5 ×100至13.5 × 10-9μg/mL，結(jié)果顯示其靈敏度至13.5 ×10-7μg/mL(圖2)。

2.4 初步應(yīng)用

提取60份樹鼩血DNA，PCR方法檢測(cè)樹鼩腺病毒結(jié)果均為陰性。提取56份樹鼩糞便DNA，使用該引物擴(kuò)增，有些DNA樣品在495 bp左右出現(xiàn)兩條疑似條帶(圖3)。由于這兩條帶片段大小十分相近，無法判定哪條是所擴(kuò)增的目的條帶，即495 bp-A、495 bp-B(圖4)，將兩條帶均切膠純化后測(cè)序。測(cè)序得到的序列與NCBI網(wǎng)站序列比對(duì)，495 bp-A與樹鼩腺病毒序列一致，說明該條帶為目的片段；而495 bp-B與亞希熱菌屬序列一致率為93%，為非特異擴(kuò)增。此外，將495 bp-A與495 bp-B比對(duì)，無任何相似序列。

M：100 bp marker；1：樹鼩腺病毒陽性質(zhì)粒；2：禽腺病毒I型；3：禽腺病毒III型；4：猴腺病毒-1；5：猴腺病毒-20；6：陰性對(duì)照

M：100 bp marker； 1：13.5 μg/mL； 2：13.5 ×10-1 μg/ml； 3：13.5 ×10-2 μg/mL； 4：13.5 ×10-3 μg/mL； 5：13.5 ×10-4 μg/mL； 6：13.5 ×10-5 μg/mL； 7：13.5 ×10-6 μg/mL； 8：13.5×10-7 μg/mL； 9：13.5 ×10-8 μg/mL.

M：100 bp marker；TAV：樹鼩腺病毒陽性質(zhì)粒；1-20、22-41、43-58： 56份樹鼩糞便DNA；21、42、59：陰性對(duì)照

使用DNAstar軟件將495 bp-A序列與NCBI網(wǎng)站上提供的樹鼩腺病毒、猴腺病毒I型、人腺病毒、禽腺病毒I型及III型序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并作出遺傳進(jìn)化樹(圖5、6)。由圖可知，TAV-495-A與樹鼩腺病毒比對(duì)一致率為100%。與禽腺病毒相比，樹鼩腺病毒與同為靈長(zhǎng)類的人腺病毒、猴腺病毒I型序列同源性最高。

3 討論

Darai等[5]1980年報(bào)道從38份樹鼩腎組織培養(yǎng)物中分離到1株TAV，能凝集大鼠和人“O”型紅細(xì)胞。陳元鼎等[6]1987年報(bào)道，從90份成年云南樹鼩大便中檢測(cè)到12份腺病毒陽性樣本，陽性率為3%。吳小閑等[7]1990年報(bào)道，從云南野生樹鼩咽拭子、腎細(xì)胞培養(yǎng)物和糞便中分離出10株TAV，并鑒定為2個(gè)血清型(TAV-1和TAV-2)。韓建保等[8]使用人源ELISA試劑盒對(duì)272份野生俘獲和人工繁殖的中緬樹鼩血清樣本進(jìn)行腺病毒等六種病毒的檢測(cè)，結(jié)果腺病毒IgG抗體均為陰性。

M：100 bp marker；1-4：495 bp-A條帶；5：樹鼩腺病毒陽性質(zhì)粒；6-9：495 bp-B條帶

圖5 TAV-495-A與多個(gè)種屬腺病毒序列的同源性比較

圖6 TAV-495-A與多個(gè)種屬腺病毒間的遺傳進(jìn)化樹

本研究中由于沒有標(biāo)準(zhǔn)毒株及分離株，人工構(gòu)建了陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽性對(duì)照。根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的TAV序列，通過與人腺病毒、猴腺病毒、鼠腺病毒及禽腺病毒的序列比對(duì)，選擇其特異區(qū)域(即19418-19917區(qū)域)人工合成一段DNA序列，插入pMD18-T載體，構(gòu)建了陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

根據(jù)構(gòu)建的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，并進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了TAV的PCR檢測(cè)方法，結(jié)果顯示該方法特異性好，靈敏度可至13.5 x10-7μg/mL。

使用該P(yáng)CR方法對(duì)60份樹鼩血DNA檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。對(duì)56份樹鼩糞便DNA檢測(cè)，結(jié)果顯示有目的條帶擴(kuò)增，此外發(fā)現(xiàn)有非特異性條帶擴(kuò)出。由于非特異性條帶與目的條帶的大小相近，對(duì)兩個(gè)片段均進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果顯示，測(cè)序證實(shí)樹鼩糞便中TAV感染率為42.9%，與PCR擴(kuò)增結(jié)果一致。非特異條帶的測(cè)序結(jié)果與亞希熱菌屬序列一致率為93%，這說明糞便樣本中可能存在這類菌屬感染。實(shí)驗(yàn)中對(duì)56份樹鼩糞便進(jìn)行DNA提取時(shí)，未對(duì)糞便進(jìn)行稀釋后除菌過濾，而是將糞便中所含的病毒、細(xì)菌DNA均進(jìn)行提取后實(shí)驗(yàn)。這提示做病毒PCR檢測(cè)時(shí)，最好將樣本除菌過濾，以降低細(xì)菌的非特異性擴(kuò)增的幾率。

本研究對(duì)云南來源樹鼩糞便樣本檢測(cè)中，顯示腺病毒的陽性率達(dá)42.9%。樹鼩作為近年來最有潛力的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，并進(jìn)行系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化工作，其病毒感染情況應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技界的足夠重視。

參考文獻(xiàn)：

[1] 沈培清, 鄭紅, 劉汝文, 等. 中國(guó)樹鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究進(jìn)展和展望 [J]. 動(dòng)物學(xué)研究, 2011, 32(1): 109-114.

[2] 角建林, 劉汝文, 陳麗玲, 等. 樹鼩資源的開發(fā)利用與標(biāo)準(zhǔn)化研究——我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源建設(shè)發(fā)展戰(zhàn)略探討 [J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 19(7): 73-78.

[3] 賀爭(zhēng)鳴.我國(guó)資源動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化潛力與展望 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 20(3):1-7.

[4] 殷震, 劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué) [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1997：1104-1129.

[5] Darai G, Matz B, Flügel RM, et al. An adenovirus from tupaia (tree shrew), growth of the virus, characterization of viral DNA and transforming ability [J]. Virology, 1980, 104-122.

[6] 陳元鼎, 戴國(guó)珍, 李軍, 等. 樹鼩大便中腺病毒的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中國(guó)人獸共患病雜志, 1987, 3(3): 2-4.

[7] 吳小閑, 唐恩華, 張新生, 等. 樹鼩腺病毒(I和II型)的生物學(xué)性狀、抗原關(guān)系和血清抗體的研究 [J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào), 1990, 12(2): 153-156.

[8] 韓建保, 張高紅, 段勇, 等. 中緬樹鼩自然感染六種病毒的血清流行病學(xué) [J].動(dòng)物學(xué)研究, 2011, 32(1): 11-16.