在體大鼠心肌缺血再灌注損傷中NF－κBp65與AngⅡ的關系

楊 銳，王芬珍

（1.浙江省寧波市第一醫院心血管內科 315000；2.福建省福州市心血管病研究所 350009）

隨著20世紀80年代心臟介入治療學的推廣，心肌缺血再灌注損傷（IRI）成為一大研究熱點。其中NF－κB及AngⅡ均參與了心肌IRI的發生發展，在此病理過程中兩者的關系也備受關注。已有研究表明，NF－κB是AngⅡ的前體血管緊張素原再合成的重要調節因子［1］，NF－κB激活可增加組織AngⅠ及AngⅡ水平，并在轉錄水平影響AT1RmRNA表達［2］；同時AngⅡ也能激活NF－κB，且有研究認為AngⅡ誘導促炎細胞因子表達是通過NF－κB／IκB信號轉導通路實現的。在此，我們將進一步探討心肌IRI中NF－κB與AngⅡ的關系。

在前期實驗的基礎上，我們觀察到缺血30min再灌注60 min（I30minR60min）為 NF－κBp65蛋白表達的高峰點，利用抗氧化劑四氧吡咯二硫氨基（PDTC）及咪達普利分別作為NF－κB和血管緊張素轉化酶（ACE）的特異性抑制劑，探討NF－κBp65與AngⅡ在心肌IRI中的關系及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性健康清潔型SD大鼠32只，體質量250～300g，由福建醫科大學動物中心提供。許可證號SCXK（閩）2004－0002，參照文獻報道的方法稍加改進建立動物模型［3］。按照隨機數字表法分為4組：（1）IR組：缺血30min再灌注60min；（2）PDTC＋IR組：PDTC 125mg／kg，用0.85%的生理鹽水稀釋，于缺血前15min腹腔注射；（3）咪達普利＋IR組：咪達普利3mg／kg，用0.85%的生理鹽水稀釋，于缺血前15min頸外靜脈緩慢推注；（4）PDTC＋咪達普利＋IR組：PDTC 125mg／kg及咪達普利3mg／kg分別于缺血前15min腹腔注射及頸外靜脈緩慢推注。

1.2 標本的采集與處理 實驗結束相應時間點取材。（1）取血：含蛋白酶抑制劑的真空試管備用，迅速下腔靜脈取血2mL加入試管，用于血漿AngⅡ水平的檢測；（2）取組織：迅速剪取平行房室溝下2mm處的左室游離壁心肌，分成2塊，一塊在液氮中速凍后保存到－80℃冰箱用于核蛋白提取；另一塊新鮮組織盡快勻漿用于組織AngⅡ水平的檢測。

1.3 免疫組織化學分析法 定位和定量檢測NF－κBp65活性：光學顯微鏡下觀察心肌細胞，如出現棕黃色顆粒為陽性表達，活化的 NF－κBp65定位于細胞核；在高倍顯微鏡下（×200），每組切片選取10個視野，細胞總數不少于500個，計算陽性細胞數的百分數，用陽性表達率表示NF－κBp65活化蛋白的核易位表達量。

1.4 ELISA法檢測心肌組織NF－κBp65蛋白轉錄活性 提取心肌組織細胞核蛋白，按照考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒說明書，定量細胞核蛋白數量，按TransAM NF－κBp65蛋白活性檢測試劑盒說明書進行ELISA。

1.5 放射免疫分析法測定血漿和心肌組織AngⅡ含量 按試劑盒說明書，采用均相競爭放射免疫分析法直接測定血漿和心肌中的AngⅡ含量。

1.6 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行分析。計量資料以表示，各組間比較采用兩因素兩水平的析因分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組NF－κBp65蛋白核易位變化及NF－κBp65蛋白轉錄活性比較 由圖1、表1可見：PDTC＋IR組、咪達普利＋IR組及PDTC＋咪達普利＋IR與IR組相比，均顯著抑制NF－κBp65蛋白核易位變化，兩藥聯合效果更明顯，各組之間差異均有統計學意義（均P＜0.05）；進一步檢測 NF－κBp65DNA轉錄活性，同樣，各藥物預處理組與IR組相比也可顯著抑制NF－κBp65蛋白的DNA轉錄活性，兩藥聯合效果更明顯，各組之間差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

圖1 免疫組織化學分析法測定各組NF－κBp65蛋白核易位變化（×400）

表1 藥物預處理對NF－κBp65蛋白核易位的影響（，n＝8，%）

表1 藥物預處理對NF－κBp65蛋白核易位的影響（，n＝8，%）

＊：P＜0.05，與IR組比較。

核陽性表達率IR組組別53.82±6.22 PDTC＋IR組 30.37±3.44＊咪達普利＋IR組 43.20±4.58＊PDTC＋咪達普利＋IR組 12.26±1.03＊

2.2 各組血漿及心肌組織AngⅡ水平的變化 由表2可見，各藥物處理組與IR組相比，血漿及組織AngⅡ水平顯著下降，兩藥聯合效果更明顯，各組之間差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 藥物預處理對血漿及組織AngⅡ水平的影響（，n＝8）

表2 藥物預處理對血漿及組織AngⅡ水平的影響（，n＝8）

＊：P＜0.05，與IR組比較。

組別 血漿AngⅡ（pg／mL）組織AngⅡ（pg／100mg）IR組471.00±48.6194.24±13.08 PDTC＋IR組 378.33±31.83＊ 63.17±6.11＊咪達普利＋IR組 306.00±42.14＊ 55.73±7.31＊PDTC＋咪達普利＋IR組 284.83±26.72＊ 44.90±7.04＊

3 討 論

PDTC是NF－κB的特異性抑制劑，主要作用是：（1）具有抗氧化性，體外研究證實它可直接清除反應性氧中介物或與其相關酶的金屬離子發生螯合作用，抑制酶活性［4］，從而抑制NF－κB激活；（2）通過阻止IκB與 NF－κB分離、阻礙 NF－κB核易位等途徑阻斷NF－κB激活的信號轉導通路［5］；（3）具有促氧化作用，通過螯合Cu2＋產生的復合物能氧化NF－κB的巰基而抑制其活性［6］。

血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）中的咪達普利是新一代、長效ACEI類藥物，其活性代謝產物咪達普利拉與體內ACE結合，降低ACE活性，高選擇性作用于腎素血管緊張素醛固酮系統（RAS），從而強效而持久的抑制AngⅡ的生成［7］。

從實驗中筆者不難發現，與IR組比較咪達普利預處理在顯著降低血漿及組織AngⅡ含量的同時也伴隨著NF－κBp65蛋白活性的下降，提示咪達普利可能通過抑制AngⅡ的表達在一定程度上抑制NF－κBp65活性。已有多項研究表明ACEI和／或AngⅡ受體阻滯劑可通過抑制NF－κB激活對心肌IRI的病理過程有所改善［8－9］。AngⅡ可以作為一個內源性促炎癥因子激活 NF－κB從而增加氧化應激等作用［10］。Dostal等［11］指出AngⅡ可作為一個生長調節因子，促進多種細胞生長因子的合成和釋放包括 NF－κB。Muller等［12］報道轉腎素、血管緊張素原雙基因大鼠心肌細胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞NF－κBp65蛋白表達增加，提示AngⅡ介導的心血管損害與NF－κBp65活性有關。Marta等［13］發現AngⅡ可提高培養的大鼠血管平滑肌細胞中NF－κB的結合活性，AngⅡ受體阻滯劑可阻斷這一作用并呈劑量依賴性。因此筆者推測在心肌IRI中，激活的AngⅡ甚至RAS可激活NF－κB轉錄系統，兩者共同參與此病理過程。

其次筆者發現，與IR組比較PDTC預處理在顯著抑制NF－κBp65蛋白DNA轉錄活性的同時也伴隨血漿及組織AngⅡ含量的降低，提示PDTC可通過抑制NF－κBp65的激活在一定程度上抑制AngⅡ。Muller等［12］曾指出，PDTC可通過抑制NF－κB激活保護AngⅡ誘導的炎性反應及器官損傷。Brasier等［14］發現，NF－κB是 AngⅡ前體－血管緊張素原再合成的重要調節因子，因此AngⅡ的致炎作用在一定程度上依賴NF－κB的調節。對AT1受體基因序列分析也發現其啟動序列含有NF－κB的結合序列，提示NF－κB可能會誘導AT1受體表達［15］。因此，筆者推測在心肌IRI中，NF－κBp65轉錄系統的激活對AngⅡ甚或RAS的激活有影響，兩者共同參與此病理過程。

最后，從藥物預處理的角度上，筆者發現咪達普利、PDTC或兩藥聯合預處理均抑制AngⅡ與NF－κBp65活性，ACEI類藥物對心臟的保護已毋庸置疑，PDTC的使用仍處于實驗室階段，以此為新的靶點，可能為臨床防治心肌IRI提供更多的途徑。

綜上所述，心肌IRI是多種生物活性因子參與的復雜病理過程，涉及多種復雜細胞信號轉導機制，其中AngⅡ或RAS與NF－κBp65可相互激活，并在多層次和諸多環節存在交互作用。

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