C反應蛋白快速定量檢測試劑盒性能評價

施國民，徐 斐

C反應蛋白(C-reaction protein，CRP)是重要的急性期反應標志物［1］，在各種急性和慢性感染、組織損傷、惡性腫瘤、手術創傷時會迅速升高，病變緩解時又迅速降至正常水平［2-5］，因此廣泛應用于細菌或病毒所致急性感染性疾病及其他各類炎癥性疾病的診斷和鑒別，手術后感染和抗生素療效的觀察，病情嚴重程度的監測及預后判斷等［6-8］。

目前，臨床實驗室定量檢測CRP的方法主要有放射免疫測定法、酶聯免疫吸附法、膠乳免疫比濁法等。其中放射免疫測定法由于存在輻射污染，已較少應用。酶聯免疫吸附法耗時較長，不適合批量檢測。膠乳免疫比濁法分為透射比濁法和散射比濁法，前者用于生化分析儀，后者用于特定蛋白分析儀。特定蛋白分析儀比生化分析儀體積小巧，檢測耗時更短，數分鐘內即可出結果，特別適用于門、急診和床邊監護使用。目前特定蛋白分析儀的試劑多依賴于進口，價格較為昂貴。我們將CRP單克隆、多克隆抗體用EDC/NHS共價法與羧基化聚苯乙烯微球結合，制備出用膠乳免疫比濁法檢測CRP的試劑。本文對研制的CRP檢測試劑盒性能進行評價。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 血液樣本來源于南京市第一醫院和南京醫科大學第二附屬醫院門診檢驗科，按適用于臨床實驗室檢驗的方法采集，采集后及時測定。

1.2 儀器與試劑 CRP檢測試劑盒(膠乳免疫比濁法)為本實驗室自行研制，批號 20110707、20130117。CB100型特定蛋白分析儀為南京卡博生物科技有限公司生產。CRP質控及校準品購自比利時APTEC公司，質控品濃度為5.3和20 mg/L，批號C3127。校準品濃度為90和155 mg/L，批號S3134。牛血清白蛋白購自Roche公司。實驗所用的對比試劑、儀器為芬蘭GENE SCIENTIFIC公司生產的CRP高敏感干化學微粒增強型免疫比濁測定試劑盒，QuikRead 101型蛋白免疫分析儀。

1.3 實驗方法 按照《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則(征求意見稿)》［9］所規定的方法，測定對自制試劑盒的檢測限、精密度、線性范圍、回收率、貯存穩定性，并與國外同類試劑盒進行200例臨床對比研究。

1.3.1 檢測限 用等滲鹽水制備5%牛血清白蛋白作為空白樣品，重復測定20次，計算均值及標準差，以空白均值加2倍標準差作為試劑盒的檢測限。

1.3.2 精密度 用5.3和20 mg/L濃度的質控品評估試劑盒的精密度。每天上午、下午各進行1次測試，每次對同一樣品重復檢測3次，連續20天，分別計算批內精密度和批間精密度。

1.3.3 線性范圍 將樣本稀釋為11個濃度:1、22.4、43.8、65.2、86.6、108.0、129.4、150.8、172.2、193.6、215 mg/L。在同一天內用同一批號試劑盒對所有樣本測定4次，取其均值進行線性回歸分析。

1.3.4 回收率 取CRP濃度為20 mg/L的新鮮人血樣本，分為體積相同的3份，第一份加入10%體積90 mg/L的校準品，第二份加入10%體積155 mg/L的校準品，第三份加入10%體積的生理鹽水，每個樣本測試3次，計算平均回收率。以CLIA'88(美國臨床實驗室改進修正法規’88)的總允許誤差(TEa)為臨床可接受性標準，小于1/2TEa作為臨床可接受水平。

1.3.5 貯存穩定性 用新配制的20130117批號試劑和穩定期末的20110707試劑對2份CRP水平不同(7和20 mg/L)的新鮮人血清樣本同時測定6次，對兩組結果進行t檢驗，比較檢測結果的一致性。

1.3.6 與國外試劑盒比較 分別用自制試劑盒與對比試劑盒對200份血清樣本進行檢測，其中CRP異常的樣本60份，比較2種試劑盒的測定結果。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩組間均數比較用t檢驗。兩種試劑盒檢測結果的相關性用Pearson分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢測限 為0.72 mg/L。

2.2 精密度 在5.3和20 mg/L兩個濃度水平的批內變異系數分別為3.09%和6.75%，批間變異系數分別為6.47%和6.84%，符合市售試劑盒精密度要求(批內、批間變異系數均小于10%)，在臨床可接受范圍內。

2.3 線性范圍 在濃度為1～215 mg/L范圍內，線性關系良好，其直線回歸方程為 Y=21.799X－21.703，線性相關系數(r)=0.99。

2.4 回收率 平均回收率為112.5%，系統誤差(系統誤差=100%－平均回收率)為2.5%，小于1/2TEa，臨床可接受。

2.5 檢測試劑盒的貯存穩定性 新配試劑與處于穩定期末試劑對兩個水平的新鮮人血樣本測定所得結果比較差異無統計學意義(P＞0.05)。自制試劑盒貯存有效期為18個月，市售同類試劑盒一般為12個月，與之相比自制試劑盒的貯存有效期更長。

2.6 與國外試劑盒的比較 對自制試劑盒與對比試劑盒檢測200份樣本所得結果進行相關分析，結果顯示2種試劑盒相關性良好，線性回歸方程為Y=1.0347X－0.3894(r=0.997，P ＜0.01)。自制試劑盒檢測結果為(30.1±42.0)mg/L，對比試劑盒檢測結果為(30.6±43.5)mg/L，兩者比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

CRP是最重要的急性時相反應蛋白之一，對于各種感染和炎癥過程、組織損傷與壞死及修復過程的評估與療效判斷都具有重要臨床價值［10］。我們對自制CRP檢測試劑盒的檢測限、精密度、準確度、線性范圍、貯存穩定性進行了評價。結果表明自制試劑盒測定結果準確、穩定，可滿足臨床檢測需求，價格較進口試劑低廉，適合大規模臨床推廣利用。

［1］稅國順，何代莉，楊曉紅.C-反應蛋白的測定及臨床應用［J］.現代醫藥衛生，2005，21(11):1365-1366.

［2］周 宓，潘柏申.C-反應蛋白在臨床應用中的進展［J］.國外醫學:臨床生物化學與檢驗學分冊，2005，26(1):56-57.

［3］楊 朵，胡 梅，李 莉，等.C-反應蛋白及降鈣素原在血流細菌感染診斷中的應用價值［J］.中華醫院感染學雜志，2013，23(22):5632-5633.

［4］余 豐，梁飛立，何艷英，等.C-反應蛋白水平與HIV/AIDS患者抗病毒治療預后關系的研究［J］.中華醫院感染學雜志，2013，23(19):4616-4618.

［5］周志宇，韋成聰，趙冠焱，等.顱腦損傷后腦脊液C反應蛋白動態變化及臨床意義［J］.中華實用診斷與治療雜志，2013，27(2):118-120.

［6］Clyne B，Olshaker JS.The C-reactive protein［J］.J Emerg Med，1999，17(6):1019-1025.

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［8］葉應嫵，王毓三.全國臨床檢驗操作規程［M］.3版.南京:東南大學出版社，2006:121-122.

［9］國家食品藥品監督管理局醫療器械技術審評中心.體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則(征求意見稿)［Z］.2009-06-01

［10］宋 娜，張家云，余小紅，等.兩種檢測方法測定C反應蛋白的比較［J］.檢驗醫學，2012，27(4):257-260.