茵陳多糖提取工藝優化

徐紅欣，管立，回鵬，陳秋玲

(河北大學 藥學院，河北省藥物質量分析控制重點實驗室，河北 保定 071002)

茵陳為菊科植物濱蒿(ArtemisiascopariaWaldst Et Kit)或茵陳蒿(ArtemisiacapillariesThunb)的干燥地上部分.苦、辛、微寒，歸脾、胃、肝、膽經，清濕熱，退黃疸，常用于黃疸尿少、濕瘡瘙癢、傳染性黃疸型肝炎等.其含有香豆素、黃酮、色原酮、有機酸、烯炔、三萜、甾體、多糖和醛酮等多類化學成分，其多糖主要含有葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、半乳糖及果糖等組分[1-2].茵陳多糖具有抑菌[1,3]、護肝、調節細胞免疫平衡[4-7]、抗鼻咽癌[8]、抑制幽門螺旋桿菌對胃癌上皮細胞的粘附[9]等多方面的藥理作用.目前對茵陳多糖提取工藝的研究基本上還是空白，本文利用單因素和均勻設計實驗優化了茵陳多糖的提取工藝，得到的優化工藝條件為：提取溫度100 ℃，提取時間80 min，提取液(mL)固(g)比50∶1,提取1次.驗證實驗3次，平均得率為2.25%，與預測值2.26%相比，誤差僅為0.44%.

1 儀器與試劑

FA2104N型電子分析天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；HH-1數顯恒溫水浴鍋(金壇市晶玻實驗儀器廠)；80-2離心機(上海榮泰生化工程有限公司)；RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；GZX-9070電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；DZF-6050真空干燥箱(鞏義市予華儀器責任有限責任公司)；SHD-Ⅲ型循環水式多用真空泵(保定市新區陽光科教儀器廠)；BCD-223MT冰箱(河南新飛電器有限公司)；722可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；移液槍(上海佳安分析儀器廠)；95%乙醇(分析純，天津市美琳工貿有限公司)；苯酚(分析純，天津市福晨化學試劑廠).蒸餾水(實驗室自制)；茵陳(河北省安國藥材市場)，經筆者鑒定為茵陳蒿ArtemisiacapillariesThunb 的干燥地上部分.

2 實驗方法

2.1 茵陳多糖的提取工藝流程

將茵陳蒿在70 ℃真空干燥3 h后，粉碎，過篩，精確稱取2.5 g于250 mL茄型瓶中，加入規定液固比的蒸餾水，在選擇的水浴溫度加熱回流規定時間，過濾，將濾液真空旋轉蒸發濃縮至約10 mL，加體積分數為95%乙醇30 mL，置具塞錐形瓶中，放置冰箱4 ℃過夜，然后離心棄去上清液，取沉淀，于50 ℃真空干燥，精密稱重.

2.2 提取工藝最優參數的確定

在單因素實驗時，依次改變提取液固比、提取溫度、提取時間，以純多糖得率為評價指標進行分析，并在此基礎上確定均勻設計實驗的參數，均勻設計實驗方案及結果見表1.

2.3 苯酚硫酸法測定多糖含量

2.3.1 標準曲線的繪制

儲備液的制備：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖0.125 9 g，加蒸餾水溶解，轉移至100 mL容量瓶中定容，搖勻得125.9 mg/L的儲備液.

標準液的制備：分別精密量取儲備液1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 mL，置于25 mL的容量瓶中定容，則得5個不同濃度的標準液.

50 g/L苯酚溶液的制備：取苯酚100 g，加入鋁片0.2 g，碳酸氫鈉0.2 g，蒸餾，收集(180±2) ℃餾分，稱取餾分1.2512 g于燒杯中，用約50 ℃的蒸餾水溶解，轉移至250 mL棕色容量瓶中定容，置于冰箱中備用.

標準曲線的繪制：分別移取2 mL各濃度標準溶液于具塞試管中，快速加入1 mL 50 g/L的苯酚溶液，充分混勻，再移取5 mL濃硫酸快速加入其中，蓋好試管塞，充分搖勻.沸水浴15 min，冷水浴10 min，室溫放置5 min.以蒸餾水為空白對照，分別在490 nm處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，以葡萄糖標準溶液c為橫坐標，繪制標準曲線，得方程：A=0.014 6c+0.074，相關系數：r2=0.999 2，線性為：10.072～50.360 mg/L.

2.3.2 茵陳多糖含量的測定

精密稱取實驗所得粗多糖約0.010 0 g于小燒杯中，加少量蒸餾水攪拌溶解，轉移至250 mL容量瓶中定容，得茵陳多糖供試品溶液.移取2 mL供試品溶液于具塞試管中，加入1 mL 50 g/L的苯酚溶液，充分混勻，再加入5 mL濃硫酸，充分混勻.沸水浴15 min，冷水浴10 min，室溫放置5 min，在490 nm處測定吸光度，以蒸餾水為空白對照.依標準曲線方程計算多糖濃度及產率.

3 結果與討論

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 提取液固比對茵陳多糖產率的影響

采用提取溫度80 ℃，提取時間2.5 h，提取1次，考察了液固比對多糖產率的影響.考察液固比依次為40∶1，50∶1，60∶1，70∶1，80∶1，多糖產率分別為1.56%，1.70%，1.44%，1.41%，1.39%，如圖1所示.

圖1表明，液固比在40∶1和50∶1之間純多糖產率共提高8.97%，在50∶1到60∶1之間，反而大幅度下降15.29%，在60∶1與80∶1之間仍呈下降趨勢，但下降趨勢已不明顯.判斷液固比到達50∶1之后，多糖成分已基本溶出，所以液固比50∶1左右最為合適.

3.1.2 提取溫度對茵陳多糖產率的影響

采用提取液固比為40∶1，提取時間2.5 h，提取1次，考察了提取溫度對多糖產率的影響.考察溫度為60，70，80，90，100 ℃，多糖產率分別為1.05%，1.13%，1.46%，1.61%，2.30%，如圖2所示.

圖1 提取液固比對茵陳多糖產率的影響 Fig.1 effect of liquid-solid ratio on Artemisia capillaris polysaccharides yield

圖2 提取溫度對茵陳多糖產率的影響 Fig.2 effect of extracting temperature on Artemisia capillaris polysaccharides yield

由圖2可以看出，隨著溫度的上升，純多糖產率呈上升趨勢，說明溫度的提高對多糖的溶出有幫助，得出多糖的最佳提取溫度為100 ℃.

3.1.3 提取時間對茵陳多糖產率的影響

采用提取溫度80 ℃，提取液固比40∶1，提取1次，考察了提取時間對純多糖產率的影響.考察時間分別為0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，多糖產率相應依次為1.57%，1.73%，1.62%，1.56%，1.50%.如圖3所示.

圖3 提取時間對茵陳多糖產率的影響 Fig.3 Effect of extraction time on Artemisia capillaris polysaccharides yield

由圖3可以看出，提取時間超過1.5 h后多糖產率并未繼續增加，反而下降；而1.5 h之前，多糖產率呈增加趨勢且1.5 h時達到最高，故1.5 h左右為最佳提取時間.

3.2 均勻設計實驗結果

依據之前單因素實驗結果，確定了溫度、液固比和時間這3個因素的取值范圍：提取溫度X1∶55～100 ℃；液固比X2∶30∶1～75∶1；提取時間X3∶50 ～140 min.所設計均勻設計實驗方案及結果見表1.

表1 均勻設計實驗方案U10(103)及結果Tab.1 Uniform design experimental program U10 (103) and results

用SPSS 19.0以純多糖得率為因變量，以提取溫度、提取液固比、提取時間為自變量進行回歸分析，得回歸方程如表2所示.

表2 回歸方程列表Tab.2 Regression equation list

表2中，Y為純多糖產率，X1為提取溫度，X2為提取液固比(取其倍數值用于回歸)，X3為提取時間.方程1為X1，X2，X3及其所有交叉作用項采用逐步回歸分析所得；方程2為X1,X2,X3以進入方式回歸所得.在模型匯總中，方程1調整R2=0.983，剩余標準差為0.214 17，P<0.01；方程2調整R2=0.992，剩余標準差為0.014 833，P<0.01.由調整R2值及剩余標準差可知兩個方程均高度有效，方程2優于方程1,方程2的最大預測值為2.26%，綜合兩個方程顯示的關系及前面單因素實驗和均勻設計實驗的結果，得出優化提取條件為提取溫度100 ℃，提取液固比50∶1，提取時間80 min,提取1次。

3.3 優化提取工藝的驗證

按上述工藝條件重復3次進行驗證.結果純多糖產率分別為2.20%，2.26%，2.29%，平均值為2.25%，與理論得率2.26%相比，誤差僅為0.44%.

另外，在優化工藝條件下，提取3次，純多糖得率分別為2.20%，2.36%，2.39%，平均值為2.32%，與前述提取1次平均值2.25%相比，僅提高3.11%，說明在此工藝條件下，提取1次已經比較完全，從成本計，沒有必要再增加提取次數.

4 結論

以上實驗得出茵陳多糖的優化提取條件為：提取溫度為100 ℃，提取液固比為50∶1，提取時間為80 min， 提取次數為1次，純多糖得率可達2.25%.

均勻設計在實驗條件范圍變化大而需要進行多水平實驗的情況下，與正交設計相比可極大地減少實驗次數，本實驗結果的處理采用回歸分析方法，建立了可定量描述指標和因素間關系的數學模型.驗證實驗的真實值與理論值十分接近，說明本實驗采用均勻設計和回歸分析方法得到的實驗參數較為可靠，為茵陳多糖的進一步開發利用打下些許基礎.

參 考 文 獻:

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