不同產地蒺藜藥材中氨基酸成分比較分析

紀思宇，申 樞，李瑞海，賈天柱，王 東

0 引言

蒺藜為蒺藜科蒺藜屬植物蒺藜(TribulusterrestrisL.)的干燥成熟果實，性微溫，味辛苦，有小毒。入肝、肺經，具有平肝解郁、活血祛風、明目止癢的功效[1]。用于“頭痛眩暈、胸肋脹痛、乳閉乳癰、目赤翳障、風疹瘙癢”[2]。其果實始載于《神農本草經》，列為上品[3]。本試驗收集不同產地的18份蒺藜商品藥材，對其中的氨基酸成分的種類與含量進行測定并分析比較，以期為蒺藜藥材質量評價提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 P230II大連依利特氨基酸自動分析儀；UV230II紫外檢測器(大連依利特公司)；ALC-110.4電子分析天平(北京賽多利斯特儀器系統有限公司)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；SF-130B高速粉碎儀器機(上海冠聯制藥裝備有限公司)；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 試藥與材料 18種氨基酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：20100108)，衍生化試劑(2，4-二硝基氟苯，大連依利特公司提供)。乙腈為色譜純；冰醋酸、N,N-二甲基酰胺為分析純；水為純凈水。蒺藜藥材產地：1江西樟樹、2山西、3安徽亳州、4福州、5安徽、6貴陽、7陜西、8江西、9河北安國、10內蒙、11河南購于黑龍江雞西、12河南購于湖南、13赤峰、14內蒙、15河南購于遼寧本溪、16河北購于廣東、17內蒙、18河北。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm，大連依利特)，柱溫：27 ℃；檢測波長360 nm；流速1.2 mL/min，梯度洗脫，洗脫曲線設定為，時間(A相百分比例%)：0(16)、0.3(16)、4(31)、9.5(36)、17(55)、28(65)、34(100)、36(100)、38(16)。

2.2 流動相的配制 A相：乙腈-水(1:1)；B相：固體組分 B 4.1 g，加水950 mL，冰醋酸調pH值至6.4～6.8，加10 mL N,N-二甲基甲酰胺，加水定容至1 000 mL量瓶中，搖勻后過濾，備用。

2.3 衍生緩沖溶液的配制 取衍生緩沖溶液固體組分A 1.24 g；固體組分B 7.63 g，加水定容至500 mL量瓶中，搖勻，備用。

2.4 平衡緩沖溶液的配制 取平衡緩沖溶液固體組分A 0.91 g；固體組分B 3.58 g，加水定容至250 mL量瓶中，搖勻，備用。

2.5 對照品溶液的制備 氨基酸對照品適量(丙氨酸5.1 mg，組氨酸5.0 mg，脯氨酸4.9 mg，精氨酸5.3 mg，亮氨酸5.6 mg，絲氨酸4.8 mg，天門冬氨酸5.3 mg，異亮氨酸4.8 mg，蘇氨酸5.0 mg，半胱氨酸5.0 mg，賴氨酸5.0 mg，色氨酸5.1 mg，谷氨酸5.0 mg，蛋氨酸4.9 mg，纈氨酸4.9 mg，甘氨酸4.9 mg，苯丙氨酸5.6 mg，酪氨酸2.7 mg)。精密稱取，加衍生緩沖溶液定容至250 mL容量瓶中，備用。

2.6 供試品溶液的制備 取樣品粉末0.1 g，精密稱定，置具塞試管中，加6 mol/L鹽酸溶液3 mL[5]，混勻，置烘箱，于110 ℃中水解24 h。水解后，樣品多次用水洗滌，從具塞試管轉入蒸發皿中，80 ℃水浴加熱蒸干。衍生緩沖溶液多次洗滌蒸發皿，轉入25 mL容量瓶中，用衍生緩沖溶液定容，混勻，0.45 μm微孔濾膜過濾。取已過濾的樣品液2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加入衍生化試劑1 mL，放入60 ℃水浴中暗處反應1 h，取出冷卻至室溫，加平衡緩沖溶液定容至刻度，靜置15 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.7 標準曲線的繪制 取“2.5”項下對照品溶液0.3、0.7、1.1、1.5、1.9 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，分別加入衍生化試劑0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按“2.6”下方法制備。進樣量為20 μL，按照“2.1”項下色譜條件，進樣測定，以各個氨基酸對照品溶液的進樣量為橫坐標X(μg)、相應的峰面積值為縱坐標Y，繪制標準曲線，各個氨基酸的回歸方程及線性范圍見表1。

表1 各氨基酸成分的回歸方程及線性范圍

2.8 方法學考察

2.8.1 精密度試驗 取對照品溶液，按“2.1”色譜條件，連續進樣6次測定，各峰面積的RSD均≤1.94%，表明精密度良好。

2.8.2 重現性試驗 取樣品6份適量(過40目篩，每份約100 mg)，精密稱定，按“2.6”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定，各色譜峰的相對峰面積的RSD≤2.0%，表明此方法具有良好的重現性。

2.8.3 穩定性試驗 取13號供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，于2、4、8、10、12、24 h進樣測定，各色譜峰的相對峰面積的RSD均≤1.98%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8.4 加樣回收率試驗 分別取已知含量的3號樣品6份粉末適量(過40目篩，每份約50 mg)，精密稱定，并分別精密加“2.5”項下對照品溶液適量，按“2.6”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，進樣測定，計算加樣回收率的RSD均≤1.85%。

2.9 含量測定 分別精密吸取各供試品溶液5 μL，按“2.1”項色譜條件，進樣測定，依據標準曲線回歸方程，計算各氨基酸的含量見表2。

表2 蒺藜藥材中氨基酸種類與含量(mg/g，產地1～9)

注：*為人體必需氨基酸，T為氨基酸總量，E為必需氨基酸總量，下同

3 討論

本試驗采用柱前衍生反相高效液相色譜法[6]，即先將氨基酸轉化成衍生物，再進行色譜分離的一種衍生方法，可在12～40 min短時間內分離出18～26種氨基酸[7]，其通用性強，具有良好的選擇性，分離度較高，靈敏度及精密度良好，隨著氨基酸研究的不斷深入，柱前衍生化法逐漸地成為氨基酸成分分析測定的一種主要方式。目前，關于蒺藜中皂苷類成分研究的文獻報道較多，而蒺藜仁中氨基酸的種類及含量未見報道，只對蒺藜仁中游離氨基酸的總含量有所報道[8]。本試驗采用此方法測定不同產地蒺藜中氨基酸的含量，并比較其差異性，確定了一種可行的蒺藜氨基酸測定方法。

由本研究可知，在18個不同產地的蒺藜藥材中，均含有所檢測的18種氨基酸，說明蒺藜藥材所含氨基酸種類較為豐富。其中包括8種人體必需氨基酸。人體必需氨基酸是生命代謝的必需物質，缺乏必需氨基酸易導致缺乏活力和精力、早衰、傷口愈合性差、兒童發育遲緩等癥狀。

表2 蒺藜藥材中氨基酸種類與含量(mg/g，產地10～18)

通過對蒺藜藥材中氨基酸含量進行比較發現，以河南產的15號藥材必需氨基酸和總氨基酸含量均為最高，而內蒙產的14號藥材總氨基酸含量最低，河北產的16號藥材必需氨基酸含量最低，說明其不同產地存在較大的差異，可能與原藥材生長環境、氣候、采收及炮制加工方法相關，也有待于進一步的研究。

本研究結果還顯示，蒺藜中以谷氨酸及天冬氨酸為主，含量較高，其中天冬氨酸可以用于治療心臟病、高血壓、肝病，且具有抗疲勞及恢復疲勞的作用，這與蒺藜的功效(活血祛風)相一致，表明天冬氨酸也是蒺藜的活性成分之一。

綜上所述，本試驗對蒺藜藥材的質量評價具有一定的實際意義，為進一步研究蒺藜藥材的質量評價提供了有價值的參考。

參考文獻：

[1] 肖培根,新編中藥志[M].北京:科學出版社,2001:11.

[2] 張健,李俊,莫琪,等.蒺藜提取物的藥理研究進展[J].中醫藥研究,1998,14(6):56-57.

[3] 江蘇醫學院.中藥大辭典[M].上海:上海人民出版社,1977:1274.

[4] 王殿波,陳斌,單舒筠,等不同生境及地區哈蟆油藥材中氨基酸成分比較分析[J].中國現代中藥,2012,14(2):8-11.

[5] 王薇,周正禮,李健,等.高效液相色譜柱前衍生法測定金銀花中氨基酸的含量[J].遼寧中醫雜志,2010,37(11):2212-2213.

[6] 梁宋平.生物化學與分子生物學實驗教程[M].北京:高等教育出版社,2003:67-73.

[7] 章麗,劉松雁.氨基酸測定方法的研究進展[J].河北化工,2009,32(5):27-29.

[8] 王學東,邵健新,翟筱,等.蒺藜中氨基酸含量的測定[J].氨基酸雜志,1994,(2):29-30.